糞便樣品的保存與運輸

時間：2014-08-21作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：107

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MOBIO較近新發(fā)布了產(chǎn)品，PowerMicrobiome RNA Kit 和PowerMag Microbiome RNA/DNA Isolation Kit，隨之而來有非常多關(guān)于糞便DNA和RNA提取方面的咨詢。其中較常問到的是，糞便樣品在進一步處理前應(yīng)如何儲藏運輸。

我詢問了人類糞便/腸內(nèi)容物方面的*Dr. Rob Knight。Dr. Knight的實驗室在American Gut Project中扮演了重要角色，它接收著來自美國各地寄來的糞便樣品。

Rob談及他在2010年發(fā)布的一篇文章，關(guān)于不同溫度條件下儲存的糞便樣品微生物群落的結(jié)構(gòu)和變化（1）。他的實驗表明，在長達兩周室溫下保存的糞便樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)保持完好，只有較小的變化。因此，室溫或使用普通冰袋運輸糞便樣品都是可以的。

從微生態(tài)學角度解釋這個現(xiàn)象。不同個體的糞便是由占不同百分比的膽汁、膽紅素、亞鐵血紅素和消化了的食物組成的復(fù)雜環(huán)境。保護微生物所處原生環(huán)境是維持微生物處于靜止狀態(tài)的較好方法。加入含高濃度鹽的防腐劑在變性蛋白的同時也會殺死部分微生物（若你經(jīng)常進食快餐和速凍披薩，那你的微生物可能比較適應(yīng)防腐劑中添加的鹽）。加入變性化學試劑較大改變所處微生態(tài)環(huán)境，防腐劑作用下仍能存活下來的微生物，在長時間的保存過程中也會不可避免地發(fā)生變化。為保護糞便樣品DNA和RNA所采取的防護措施，必須以細胞不破裂，維持微生物多樣性為前提。

反復(fù)凍融對微生物是有害的，解凍過程中冰晶體會促使細胞破裂。所以，避免樣品反復(fù)凍融可減少不穩(wěn)定菌種的損失。對于RNA提取，反復(fù)凍融的危害較不用說。

對于RNA

糞便RNA提取呢？需要用到一些特殊的技巧。 我們在實驗室提取糞便RNA過程中發(fā)現(xiàn)了這樣一些問題。**，糞便中充滿死細胞，宿主的和微生物的。大量降解的RNA在電泳或生物分析儀中對提取的RNA造成嚴重的背景干擾。若RNA離心柱綁定吸附過程中使用的由原來的**換用70%，離心柱回收過程可以除去低分子量的RNA。當然，如果你對microRNAs也感興趣，這個步驟還是可以繼續(xù)使用**酒精。

另一個重要因素是影響糞便容積和重量的糞便中未消化食物的數(shù)量和種類，直接減少實際進入處理的微生物細胞數(shù)量。我們有客戶已經(jīng)研發(fā)出了RNA提取前去除糞便樣品中未消食物的方法，可大大提高回收的完整RNA得率。如果你感興趣，請聯(lián)系我們。

最后，提取過程中盡快加入穩(wěn)定劑是獲得高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。有兩種穩(wěn)定劑你可加入到裂解緩沖液中。一是較常用的β巰基（BME）。β巰基是種強力還原劑，RNase有二鍵。還原劑破壞酶的空間結(jié)構(gòu)致使滅活。BME可不可逆地破壞RNase，但其難聞的氣味著實令人難受，不過至少可以拒推銷人員于門外，免得他們打擾你的實驗……

另一個選擇是加入pH7-8（PCI）。只要加入100μl就可滅活核酸酶，起穩(wěn)定作用。加樣前先把穩(wěn)定劑加入到裂解緩沖液中，樣品可快速得到保護，避免進一步降解。尤其是剛從冰箱中取出的樣品。若要給整塊96孔板加糞便樣品，處理時間至少一個小時，快速加入保護劑尤其重要。

對于已經(jīng)加入RNALater作為保護劑的糞便樣品，經(jīng)過我們RNA和DNA提取的測試證明，它是有效的。但這類樣品加樣量要控制在100mg。RNALater中的鹽與糞便成分相互作用形成沉淀。加入太多樣品容易造成硅膠濾膜堵塞，大大影響回收率。

這是目前我們對糞便樣品的了解，感謝與我們一起參與此計劃的眾多合作者。隨著我們對這種*特而重要樣品認知的增加，相信會有更多糞便研究技術(shù)會被開發(fā)出來。若你有任何建議或問題，請隨時與我們聯(lián)系！

·      1. Effect of storage conditions on the assessment of bacterial community structure in soil and human-associated samples. FEMS Microbiol Lett. 2010 June; 307(1): 80–86. Christian L. Lauber, Nicholas Zhou, Jeffrey I. Gordon, Rob Knight, Noah Fierer

 


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