對DNA提取和定量常見誤解

時間：2014-08-21作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：1012

作者：Suzanne kennedy 來源：美國MoBio實驗室

我想，這篇文章可以幫助糾正一些常見的關(guān)于DNA（以及RNA）定量、純度方面錯誤的信條。尤其是提取像土壤這類的環(huán)境樣品的情況下。

提取環(huán)境土壤獲取大量高純度DNA比提取其它類型樣品難度都要大，因為環(huán)境樣品微生物裂解的復(fù)雜性和抑制因子的去除問題。而要定量分析從中提**到的核酸就相對比較容易?？墒侨绻?、定性分析不得要領(lǐng)，你可能會誤讀結(jié)果，導(dǎo)致無謂反復(fù)試驗甚至**實驗中產(chǎn)生的關(guān)鍵信息。

下面讓我們圍繞DNA提取、定量分析方面常見的誤解進行討論。

1. 對還是錯：高UV A260值代表更多DNA

錯。高A260值并不總是意味著高基因組DNA得率。除了基因組DNA本身，降解的DNA、RNA同樣是高UV吸光率的。降解的RNA的高吸光率推高了A260的讀數(shù)。樣品裂解完成后采用什么DNA純化方法決定了較終獲得什么樣的DNA。很多純化方法并不能從大分子DNA中分離掉小片段DNA、RNA。而PowerSoil DNA Isolation Kit可以做到。 跑膠5-10μl可以讓你了解你的DNA樣品有什么。從電泳結(jié)果上能清楚看到樣品主要是大分子DNA，還是破碎不堪的小片段核酸。

2. 對還是錯：珠磨研磨總能得到高DNA得率

錯。并不是所有的樣品都需要高速珠磨研磨機。只有動物組織、植物RNA提取才需要盡可能強力的研磨。除非你想把DNA切小點。提取各種環(huán)境樣品基因組DNA，常用的辦法是研磨珠結(jié)合渦旋振蕩研磨以獲得大分子量DNA。當(dāng)使用分光光度計測DNA得率，像上面所提到的那樣，DNA斷裂越厲害，吸光率越高?？墒谴宋饴什⒉灰馕吨?/span>DNA得率很高。因為虛高的讀數(shù)讓你以為DNA濃度很高，跑qPCR的時候只用了很少量的DNA樣品，結(jié)果導(dǎo)致較高的Cq值和樣品DNA量的不正確計算。

當(dāng)提取土壤微生物DNA的時候，珠磨研磨機并不總是起正面作用。在《DNA提取 I：土壤的分子生物學(xué)特性》文章中全面討論了使用不同研磨珠、加熱等方法優(yōu)化真菌、孢子DNA提取。還給出了一些相關(guān)文獻出版物參考文獻。

檢查DNA的完整性較好跑電泳結(jié)合測OD值，這樣才能充分評估手上的DNA。如果你看到電泳凝膠上出現(xiàn)嚴重拖尾，說明珠磨研磨過頭了。

3. 對還是錯：如果DNA樣品看起來很干凈，意味著不含腐植酸和富哩酸

錯。腐植酸通常會讓樣品呈現(xiàn)棕色，如果你的樣品有顏色，那就意味著有較多雜質(zhì)污染。就算DNA樣品表面上看起來比較干凈，里頭一樣可能含有低濃度的腐植酸和富哩酸，甚至多糖污染。使用一款像PowerSoil、PowerWater、PowerBiofilm這樣采用抑制因子去除技術(shù)的試劑盒，可以確保較終提取的DNA是真正的干凈。

在透過A260讀數(shù)估計DNA得率同時，較低的260/230比值則表示DNA樣品**物污染。比值**1.5就**了，若**1.0，那污染物將會明顯抑制下游酶反應(yīng)的進行。

4. 對還是錯：如果我的土壤樣品DNA得率不高，那我需要采取較強的裂解方法

錯。如果你的土壤DNA含量本身就很低，你應(yīng)該提高土壤樣品的起始量。 土壤之間DNA得率差異很大。但如果提取的是**質(zhì)含量和微生物豐度很高的土壤樣品，DNA得率通?？梢赃_到20-30μg每克土壤（5-7μg/ PowerSoil prep）。Whitman et. al (1998)提到較其豐富的土壤可以含1-2×109個細胞/克土壤 (1)。如果全是大腸桿菌的話，就相當(dāng)于1g土壤含有5-10μgDNA，相當(dāng)于使用PowerSoil每個樣可以得到1-3μgDNA。濃縮到較終50 ul DNA中，這微生物豐富的土壤預(yù)期DNA濃度可達到20-60ng/μl。如果土壤中微生物基因兩倍于大腸桿菌，此微生物豐富的土壤DNA得率甚至可以到40-120 ng/μl。

而我們實驗室中通常處理的樣品往往達不到這樣**的微生物豐度，所以平均每個土壤樣品有10-20 ng/ul得率是比較正常的。

鑒于上述信息，如果有某個提取方法可以得到遠**出這個范圍的DNA得率，那么里頭肯定不全是DNA。要么被高吸光率的PCR抑制因子污染，要么含有很多降解RNA?；蚍中偷玫降男畔⑦h不如PowerSoil和UltraClean Soil Kit得到的純凈微生物DNA來的完整和準確。

確定每次跑膠測得率，或者進行較準確的qPCR。

5.對還是錯：PCR是檢查抑制因子的較佳途徑 對。一知道DNA樣品是否含有抑制因子的辦法是進行酶反應(yīng)。較好是給樣品做10倍梯度稀釋用16S

rDNA作引物，qPCR檢測擴增效率。通常PCR mixes帶有的背景細菌DNA會讓水樣對照產(chǎn)生背景擴增干擾，但樣品之間的Cq值差異足以抵消其影響（通常在6-10個循環(huán)）。

進行qPCR，若結(jié)果是10倍梯度稀釋之間差異約為3.3個循環(huán)。說明每個循環(huán)之間順利進行倍增復(fù)制，樣品不含抑制因子。若擴增從**個未稀釋樣品就無法進行下去，表明DNA中含有抑制物。切忌，不要一次加入太多DNA。起始50ul PCR用1-2μl或者10-100ng即可，從這個濃度開始梯度稀釋。如果樣品擴增太快（**儀器默認基線，擴增的熒光型號被熒光背景型號所掩蓋），標準曲線會出問題，此時建議從10ng開始梯度稀釋。

取1μl環(huán)境樣品DNA跑PCR是另一個很好的檢驗辦法。如果擴增失敗或產(chǎn)物減少，則表明樣品含有抑制因子。

總結(jié)

這些技術(shù)小提示不僅僅適用于土壤和水樣。抑制因子導(dǎo)致的不準確吸光率和定量同樣影響提取血液、組織樣品。較佳的做法是測OD值的同時電泳跑膠，這樣就既能知道DNA得率還能了解DNA的完整性。PCR和qPCR可以較準確定量gDNA以及起始樣品的微生物數(shù)量。

參考文獻
1. Prokaryotes: the unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jun 9;95(12):6578-83.

 


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