科研小技巧：從棉拭子提取微生物或宿主DNA

時(shí)間：2020-01-05作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：872

作者：Suzanne kennedy 來(lái)源：美國(guó)MoBio實(shí)驗(yàn)室

我們的技術(shù)團(tuán)隊(duì)常常收到一些關(guān)于提取口腔棉拭子或其它拭子DNA的咨詢(xún)。根據(jù)一些客戶(hù)反饋的信息給出下面的建議。其中是否需要珠磨研磨，取決于提取目標(biāo)是微生物DNA還是人類(lèi)（或者宿主）細(xì)胞DNA。

宿主的真核細(xì)胞在含胍裂解緩沖液和蛋白酶K的作用下很容易裂解。不需要使用到機(jī)械裂解。而微生物DNA的提取則要機(jī)械作用力輔助才能獲得理想的得率。因此，根據(jù)你的樣品類(lèi)型不同和污染程度，我們給出了幾個(gè)提取拭子DNA的建議。

提取棉拭子人類(lèi)（宿主）DNA或容易裂解的細(xì)菌：

推薦使用Blood Spin DNA Kit：

1、使用棉拭子反復(fù)刮擦口腔內(nèi)壁（8-10次）。棉拭子可室溫下干燥保存運(yùn)輸，直到有處理?xiàng)l件。

2、把拭子浸泡在200μl 10mM Tris，1mM EDTA中。若溶液不能淹沒(méi)拭子，可把溶液量增加到400μl。

3、在緩沖液中攪動(dòng)拭子一分鐘，釋放細(xì)胞。

4、可以的話摘下棉拭子頭部并留在Tube管里，否則按照步驟6方法處理，接著步驟5繼續(xù)。

5、加入等體積Blood Spin Kit的B1溶液（400μl TE緩沖液對(duì)應(yīng)400μl B1溶液）和10μl 蛋白酶K。

6、50-60℃消化30min。

7、棉拭子貼壁盡可能擠出水分，然后丟棄。

8、加入等體積（400μl）的**（B2溶液），然后把DNA綁定到兩個(gè)離心管中，每管600μl。

9、接著試劑盒原說(shuō)明書(shū)繼續(xù)進(jìn)行。

人類(lèi)或細(xì)菌細(xì)胞：

另一款提取人類(lèi)細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞的珠磨研磨試劑盒是UltraClean Tissue and Cells DNA Isolation Kit。此試劑盒使用了大直徑的石榴石研磨珠和強(qiáng)力裂解緩沖液。也引入蛋白酶K消化以提高得率。

10、從口腔（方法如上文說(shuō)描述）或環(huán)境采樣后，把拭子放入含1mL TD1裂解緩沖液的Tube管中。若你要提取微生物DNA，直接把拭子放入試劑盒提供的Bead Tube中。攪動(dòng)拭子把細(xì)胞釋放到緩沖液中?？梢缘脑挘率米拥念^部一起進(jìn)行消化處理。

12、棉拭子貼壁盡可能擠出水分，然后丟棄。

13、若提取的是微生物DNA，按照說(shuō)明書(shū)渦旋振蕩處理。若提取宿主DNA，此時(shí)可直接進(jìn)行離心柱DNA綁定步驟。

富含PCR抑制因子的樣品：

有些客戶(hù)提取的樣品富含PCR抑制因子。比如某些實(shí)驗(yàn)室用拭子采集動(dòng)物或嬰兒直腸樣品來(lái)分析糞便微生物。從環(huán)境中直接采樣，灰塵等也可能抑制PCR。此時(shí)BiOstic Bacteremia DNA Isolation Kit較適合。盒子采用了2ml 研磨管可以容納整個(gè)拭子頭，還有專(zhuān)門(mén)提取微生物細(xì)胞用的0.15mm的石榴石研磨珠。強(qiáng)力的裂解緩沖液和IRT技術(shù)可去除所有PCR抑制因子。

14、拭子放入Bead Tube中，加入450μl CB1溶液（試劑盒提供的裂解緩沖液）。

15、在緩沖液中攪動(dòng)拭子一分鐘，釋放細(xì)胞。

16、可以的話摘下棉拭子頭部并留在Tube管里。棉拭子貼壁盡可能擠出水分，然后丟棄。

17、接著說(shuō)明書(shū)繼續(xù)。難裂解微生物類(lèi)型，需要在渦旋振蕩步驟前70℃水浴15min。

18、按說(shuō)明書(shū)繼續(xù)。

雖然Bacteremia Kit采用珠磨研磨和強(qiáng)力裂解緩沖液，較適合提取微生物樣品，但如果你想提取富含抑制因子的人類(lèi)DNA（如，采樣前未禁食的人的口腔樣品），這款盒子也同樣適用。

此時(shí)，不要使用試劑盒的Bead Beating Tube，把拭子放入一個(gè)裝有450μl CB1裂解緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)微型離心管中浸泡。數(shù)分鐘后擠出拭子水分，丟棄拭子。水浴加熱裂解細(xì)胞，可加入10μl 蛋白酶K進(jìn)行消化。接著加入用于去除抑制因子CB2溶液，繼續(xù)下面步驟。

根據(jù)樣品來(lái)源和目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型，我們有許多方法提取拭子DNA。如果你有任何疑問(wèn)，或有些不同尋常的樣品需要特別的建議，請(qǐng)隨時(shí)聯(lián)系我們。

 


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