提取糞便樣品微生物DNA

時(shí)間：2014-12-19作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：199

作者：深圳市安必勝科技有限公司【字號(hào)：大 中 小】

我們常會(huì)收到剛開始入手糞便微生物組學(xué)研究者關(guān)于微生物提取的推薦處理程序、預(yù)期得率，以及合適的儲(chǔ)存方法、運(yùn)輸條件等問(wèn)題。

所以，為了幫助你們較好地規(guī)劃實(shí)驗(yàn)，我們努力從糞便DNA提取和微生物組學(xué)分析*那里收集相關(guān)技巧，讓你可快速開展自己的微生物組學(xué)實(shí)驗(yàn)。

為了收集這方面的較有利信息，我們采訪了主持Human Microbiome Project（HMP）樣品收集和DNA提取流程開發(fā)的貝勒醫(yī)學(xué)院分子病毒學(xué)和微生物學(xué)副教授Joseph Petrosino；微生物DNA提取試劑盒良好者M(jìn)OBIO研發(fā)部主管Suzanne Kennedy；TGA Sciences研發(fā)助理研究員Kate Patterson。

以下五點(diǎn)來(lái)源于他們實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)將有助于你項(xiàng)目的順利開展。

1、采樣

對(duì)于嚙齒動(dòng)物，較簡(jiǎn)單直接的辦法是收集糞粒。動(dòng)物關(guān)在籠子里，帶上無(wú)菌手套撿拾籠舍底面的糞粒，放入到BD Falcon? 或Eppendorf Tube管這樣的無(wú)菌裝置中即可。

收集人的糞便樣品或許有點(diǎn)臟。所以許多實(shí)驗(yàn)室提供一種桶狀的裝置，可放置在座廁下收集樣品。也可以用報(bào)紙接著樣品，以吸收更多水分。關(guān)鍵是要提供適當(dāng)指導(dǎo)，避免樣品受到廁紙或廁所壁的污染。指導(dǎo)也應(yīng)該包括建議先排尿，避免尿液污染糞便樣品。

若要收集肛周棉拭子，確認(rèn)使用的是滅菌棉拭子，采樣風(fēng)干一個(gè)小時(shí)后放到帶帽的無(wú)菌運(yùn)輸容器，避免微生物冷凍保存前降解。

2、樣品運(yùn)輸與保存

樣品收集后在DNA提取前可一直放在同一個(gè)容器里運(yùn)輸和保存?；蛘叻盅b后放入到特殊滅菌收集容器中。

若樣品是在家里自行收集的，應(yīng)把樣品容器放入到家庭冰箱中?？爝f到實(shí)驗(yàn)室時(shí)用冰袋保溫。實(shí)驗(yàn)室中收集的樣品可馬上冷凍保存。HMP項(xiàng)目，要求樣品在特定的收集容器中-80℃冷凍保存，24-48h內(nèi)提取DNA。也有*觀察到冷凍保存長(zhǎng)達(dá)一年的樣品的微生物多樣性與現(xiàn)場(chǎng)馬上提取的區(qū)別不大。 做微生物多樣性，我們的*一致認(rèn)為，用Qiagen的RNALater這類的保護(hù)液會(huì)影響下游DNA提取，請(qǐng)避免使用。有*觀察到使用RNALater的糞便樣品容易分層，DNA回收率下降。(糞便樣品運(yùn)輸包裝.PDF)

重復(fù)樣品分析可以減少處理過(guò)程、稱重等環(huán)節(jié)帶來(lái)的誤差。但是在嚴(yán)格遵循較佳實(shí)驗(yàn)室規(guī)范、質(zhì)量管理系統(tǒng)進(jìn)行的微生物分析質(zhì)量控制和質(zhì)量保證程序下，*重復(fù)樣品。PhloChip分析也內(nèi)建了質(zhì)量控制程序保證分析結(jié)果。

3、分開處理健康與患病個(gè)體糞便

按照BSL-2規(guī)定條件分別處理健康與患病個(gè)體，包括戴好面具、手套及穿著實(shí)驗(yàn)室工作服，避免潛在病原感染。

便秘個(gè)體糞便在后續(xù)DNA提取中需要適當(dāng)延長(zhǎng)珠磨研磨時(shí)間，稀糞需要離心去除多余液體。

4、DNA提取

現(xiàn)有很多種方案從糞便樣品中提取微生物DNA，而我們所有的*都推薦使用珠磨研磨法和MOBIO的PowerSoil? DNA Isolation Kit。非珠磨研磨法無(wú)法回收格蘭性陽(yáng)性菌DNA。使用MOBIO的PowerSoil? Isolation Kit，較終洗脫DNA濃縮了為微生物DNA，PCR敏感度較高。人或動(dòng)物的真核細(xì)胞在加熱和珠磨研磨的環(huán)境下比微生物細(xì)胞較快裂解，DNA釋放游離在上清液中。游離的DNA在長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械作用力下斷成小片段，綁定吸附步驟被沖洗掉。微生物DNA保存大分子片段狀態(tài)留在硅膠離心柱上。

我們的*們觀察到PowerSoil? Kit這類采用珠磨研磨技術(shù)的試劑盒提取0.1g糞便樣品約可獲得100μl 2-20ng/μl 的總基因組DNA。人糞便或者腸內(nèi)容物建議加樣0.1-0.25g。較為干燥的老鼠糞便，建議減少加樣量到0.1g。推薦使用試劑盒自帶的研磨珠，沒(méi)必要另外購(gòu)買玻璃或者二氧化硅研磨珠。

有*觀察到人糞便DNA中約有2%的人類DNA。相反，其它類型的樣品如陰道棉拭子提取的DNA較多可含80%人類DNA。

5、去除PCR抑制因子

糞便與土樣一樣帶有大量PCR抑制因子。抑制因子的種類因飲食結(jié)構(gòu)而異。抑制因子會(huì)吸附到離心柱硅膠濾膜上，伴隨DNA一并被洗脫下來(lái)。這類樣品的總DNA常呈黃至棕色，分光光度法讀數(shù)偏低。因此，我們推薦使用MOBIO含有抑制因子去除技術(shù)?（IRT）的PowerSoil? DNA Isolation Kit，在綁定樣品到離心柱前，去除裂解物中腐植酸、多、多糖、亞鐵血紅素和染料等雜質(zhì)，可獲得高純度的DNA，擴(kuò)增后得到較準(zhǔn)確的微生物群落結(jié)構(gòu)信息。

6、最后

參考文獻(xiàn)

1. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gelelectrophoresis. Julia R. deLipthay et al. (2004) Soil Biology and Biochemistry. 36;10:1607-1614.

2. Manual of Procedures for Human Microbiome Project.


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