抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)文庫構(gòu)建服務(wù)

時間：2012-05-16作者：上海藥巢生物工程有限公司瀏覽：60

 

抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)文庫構(gòu)建服務(wù)

抑制性消減雜交技術(shù)SSH是建立在抑制PCR與消減雜交技術(shù)相結(jié)合的較簡單、較快速的分離差異基因的方法。雜交二級動力學(xué)原理，即豐度高的單鏈DNA在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使原來在豐度上有差別的單鏈DNA相對含量達(dá)到基本一致。抑制PCR是利用鏈內(nèi)退火**鏈間退火的特點．使非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結(jié)構(gòu)，無法作為模板與引物配對從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。差異表達(dá)的cDNA(目標(biāo))存在于檢測子cDNA中而在驅(qū)趕子cDNA中缺失或豐度較低。檢測子與驅(qū)趕子雙鏈cDNA首先用四堿基限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生平末端。再把檢測子cDNA片斷分成兩份（1和2）分別與接頭1和接頭2連接，形成兩組檢測子，（1）和（2）。SSH技術(shù)用了兩次雜交，**次中把過量的驅(qū)趕子加到每份檢測子樣品中。然后將樣品熱變性并退火。檢測子單鏈cDNA片斷（a）被均化，即平均高、低豐度的cDNA濃度，使其基本相等。均化的發(fā)生是因為據(jù)雜交的二級動力學(xué)，重退火過程中高豐度分子能較快產(chǎn)生同源雜交cDNA(b)。而且，檢測子的單鏈cDNA(a) 片斷中差異表達(dá)基因的cDNA被顯著富集，而 “共有的”非靶標(biāo)cDNA與驅(qū)趕子形成異源雜交體。  在*二次雜交中，經(jīng)過**次雜交的兩份樣品被混合。只有保持均化并消減的檢測子cDNA能重新結(jié)合形成（b）,(c)和新的（e）雜交體。這一階段加入的*二部分變性驅(qū)趕子進(jìn)一步定集了差異表達(dá)基因的部分（e）。新形成的（e）雜交體具有能區(qū)分于**、二次雜交中形成的雜交體（b）和 (c)的重要特征，就是其在5 端有不同的接頭序列，一者來自于樣品1，一者來自于樣品2。這兩個序列使得在PCR中用P1和P2這對各自對應(yīng)于接頭1和2外部的引物時，可以**擴增消減和均化的片斷（e）。要完成選擇性擴增，在PCR進(jìn)程前需進(jìn)行一個延伸反應(yīng)補平這些分子粘性末端，以便于引物退火。 在所有PCR循環(huán)中，只有（e）型分子才能被指數(shù)級擴增。（b）型分子因含有長反轉(zhuǎn)重復(fù)序列末端，而在每次變性－退火PCR步驟后形成穩(wěn)定的“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)?！板伇鷺印苯Y(jié)構(gòu)不能作為指數(shù)級PCR的模板，因為長接頭序列的分子內(nèi)退火比短得多的PCR引物與模板間的分子間退火要較**和穩(wěn)定。這就是抑制性PCR的效應(yīng)。而且，（a）型和（d）型分子不含引物結(jié)合位點，（c）型分子只能以線性速率被擴增。只有（e）型分子在其末端具有不同的接頭序列，使其能夠在PCR中得到指數(shù)級擴增。抑制性消減雜交技術(shù)的基本實驗過程如下.首先，將要進(jìn)行比較的兩種組織或細(xì)胞來源的mRNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA,把含有目的基因的cDNA 稱為測(tester)，把參考cDNA 稱為驅(qū)動(driver)，用同一種限制性內(nèi)切酶Rsa I 切割，產(chǎn)生末端平頭的片段，將測試cDNA 分為兩份,每份連接不同的接頭,即:接頭1(adaptor 1)和接頭2 (adaptor 2). 接頭為雙鏈DNA 片段，且5’- 端均無基，這樣保證只有接頭中的長鏈可以與cDNA 的5’- 末端連接，兩個接頭含有可識別的序列. 接下來進(jìn)行兩次雜交. **次雜交在每個測試?yán)锛尤脒^量驅(qū)動，然后變性、退火，根據(jù)雜交動力學(xué)*二定律，即豐度越高的分子退火速度越快，因此測試cDNA與驅(qū)動cDNA相同片段大都形成異源雙鏈分子，使得差異表達(dá)的單鏈分子得到富集. *二次雜交，將進(jìn)行過**雜交的兩組樣品不經(jīng)變性而直接混合，只有剩下的經(jīng)過消減并平均化了的差異表達(dá)的單鏈cDNA 可以重新結(jié)合為新的雜交體分子，這種雜交體分子兩端帶有不同的接頭1和接頭2，加入新鮮變性的驅(qū)動進(jìn)行*二輪消減雜交，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的雜交體分子，并用DNA 酶補平末端，這樣差異表達(dá)的測試序列- 雜交體分子5'- 和3'- 端就有了進(jìn)行巢式PCR 所需的不同的退火位點. 最后，進(jìn)行兩次PCR 反應(yīng)，**次PCR 只有兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA 片段才得以指數(shù)擴增，而其他形式如一端有接頭，而另一端無接頭的只能線性擴增，沒有引物結(jié)合點的不能擴增，還有兩端為同一接頭的形成袢狀而無法獲得指數(shù)擴增. 利用巢式引物進(jìn)行*二次PCR，富集差異表達(dá)的基因片段. PCR 產(chǎn)物可以被直接插入T 載體，或者利用接頭1 上的NotI/SmaI/XmaI 位點和接頭2R 上的EagI 位點進(jìn)行定向克隆，或者接頭與cDNA 連接處的RsaI 位點平端克隆. 然后利用測序和雜交分析來分析差異表達(dá)的序列，或者用PCR 產(chǎn)物作探針來篩選DNA 文庫.抑制消減雜交技術(shù)的關(guān)鍵:tester與driver要配對密切，較好雙方是共源細(xì)胞株，這樣雙方才具有高度可比性，篩選出的差異表達(dá)基因才可能與表型關(guān)系密切，從而減少工作量、減少下一步工作的盲目性.在選用限制內(nèi)切酶時應(yīng)盡量選用對于基因組DNA是酶切位點較少的限制內(nèi)切酶，使酶切后產(chǎn)生的片段盡量大一些。接頭要含有酶切位點以連于平端cDNA上，重要的是要在其末端含有一段反向末端重復(fù)序列，這使得在PCR反應(yīng)中能選擇性擴增目的cDNA片段，同時抑制非目的cDNA片段的擴增。 一個胚胎細(xì)胞分化為不同的組織器官，或者是正常的組織突變?yōu)?*組織，都可能涉及在同一基因組背景下不同基因的差異性表達(dá)。所以尋找差異表達(dá)的基因就有可能揭示細(xì)胞分化的機制或者**的成因。基于抑制性消減雜交（SSH）的方法構(gòu)建cDNA文庫是近年來發(fā)展起來的進(jìn)行功能基因組學(xué)研究，尋找差異基因的一種非常有效的方法，該技術(shù)克服了消減雜交技術(shù)無法克隆低豐度表達(dá)基因的缺陷，并且降低了假陽性率，相對于其它差異顯示技術(shù)具有很大的優(yōu)越性。 操作程序 ： 1.由您提供相關(guān)背景材料以供參考。 2.簽訂技術(shù)服務(wù)合同，商定服務(wù)收費、任務(wù)期限等。您需要預(yù)付實驗總費用的80％作為實驗預(yù)付款。 3.由您提供實驗所需的足夠量的樣品，本公司不接受您提供的RNA樣品，除非您有足夠的證據(jù)證明所提供的RNA沒有問題。 4.進(jìn)行RNA的抽提，抑制性消減雜交按照BD Clontech的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit操作步驟進(jìn)行。 5.將擴增號的具有差別表達(dá)的序列片段克隆到T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 6.隨機挑取5個陽性克隆進(jìn)行PCR驗證。 7.提供實驗報告及構(gòu)建于T載體的差異文庫（涂布后的平板）。 　 收費標(biāo)準(zhǔn)：35000人民幣 實驗期限 ：20個工作日


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