DNA甲基化服務檢測服務

時間：2012-05-16作者：上海藥巢生物工程有限公司瀏覽：22

 

DNA化服務檢測

結合重鹽的測序法實驗流程（BSP） （Bisulfite Genomic Sequence）     原理：結合重鹽的測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA化模式的方法。重鹽處理后，用針對改變后的DNA序列設計特異性引物并進行聚合酶鏈式反應（PCR）。 PCR產物中原先非化的胞嘧啶位點被胸腺嘧啶所替代，而化的胞嘧啶位點保持不變。PCR產物克隆后進行測序。通過這個方法能得到特定位點在各個基因組DNA分子中的化狀態(tài)。該方法特點是： 1. 特異性高，它能夠提供特異性很高的分析結果，這是所有其他研究化的分析方法所不能比擬的； 2. 靈敏度高，可以用于分析少于100個細胞的檢測樣品。用微量的基因組DNA進行分析就能得到各個DNA分子精確的化位點分布圖。

圖1 結合鹽的測序法流程圖。DNA用重鹽處理后進行PCR擴增，擴增片段純化后連接進載體，轉化大腸桿菌，過夜培養(yǎng)后挑單個陽性克隆進行測序。得到每個DNA分子特定區(qū)域化位點的分布圖。

 

結合重鹽測序法技術實驗流程

A．DNA制備

用DNA抽提試劑盒（Promega, cat. no. A1125）抽提組織，細胞培養(yǎng)物，石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA。

B．重鹽處理

C．DNA純化

用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)純化重鹽處理后的DNA樣品。

D．DNA脫磺基反應

E．PCR擴增

F．PCR產物瓊脂糖電泳后回收純化，隨后連接到pGEM-T EASY 載體中克隆及測序。

 

化特異性的PCR實驗流程

（methylation-specific PCR, MSP）

原理：化特異性的PCR是一種靈敏度高且操作相對簡單的化研究方法。重鹽處理DNA后，基因組DNA發(fā)生的由化狀態(tài)決定的序列改變。隨后進行引物特異性的PCR。該方法引物設計是關鍵。MSP中設計兩對引物，即一對結合處理后的化DNA鏈（引物對M），另一對結合處理后的非化DNA鏈（引物對U）。檢測MSP擴增產物，如果用引物M能擴增出片段，則說明檢測位點存在化；若用引物U擴增出片段，則說明被檢測的位點不存在化（圖3）。該方法優(yōu)點是：

l      檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需1μg的基因組DNA，可用于石蠟包埋樣本；

l      快速、簡單，省時；

l      如果結合Real-time定量PCR技術（Taqman 探針）則能對樣品中檢測位點的化水平進行定量檢測(Methylight)。

圖2 化特異性的PCR（MSP）流程示意圖。用鹽處理后DNA分子發(fā)生了由化狀態(tài)決定的序列改變。用化特異性的引物（primer M）和非化特異性的引物（primer U）進行擴增。只有結合完全的化或

MSP技術實驗流程

A．DNA抽提

用DNA抽提試劑盒（Promega, cat. no. A1125）抽提組織，細胞培養(yǎng)物，石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA。

B. 重鹽處理

C．DNA純化

用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)純化重鹽處理后的DNA樣品。

D．DNA脫磺基反應

E．化特異性的PCR反應

針對改變后的DNA序列設計兩對引物（M，U），進行PCR反應。為了避免非特異性擴增用TaKaRa的hotstart酶。隨后對PCR產物的凝膠電泳圖進行分析。

實例：

檢測肝癌細胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因啟動子化。重鹽處理后，針對改變的DAN序列設計兩對引物

M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp

U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp




圖3 Bel 7404細胞系SFRP1基因啟動子被完全化，Bel 7405細胞系該基因啟動子被部分化。


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