病原微生物提取

時間：2022-06-30

什么是病原微生物？

病原微生物是指侵犯入人體引起感染的微生物，或稱病原體。病原微生物包括病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲和朊毒體等。mNGS就是綜合分析來自患者樣本的病原微生物的基因物質(zhì)（DNA和RNA），實現(xiàn)病原種屬的快速鑒定和深入分析。mNGS檢測技術(shù)由于通量高、快速、成本適宜、準確度高等特點，在感染性疾病領(lǐng)域應用愈發(fā)火熱，同時也正在改變原有的檢測手段，大大提高了危急重癥和疑難感染的診斷水平。

為什么要去除宿主DNA？

mNGS檢測流程包括：臨床評估、樣本收集、保存和運輸、核酸提取、文庫構(gòu)建、上機測序、數(shù)據(jù)分析和出具報告幾大步驟。多數(shù)臨床標本存在大量宿主細胞和宿主游離核酸，微生物核酸豐度相對較低，有些樣本中人源宿主DNA占比高達50-90%左右，這會導致后續(xù)測序數(shù)據(jù)中大部分是宿主DNA的信息，而病原微生物的數(shù)據(jù)占比較少，且宿主DNA 的非特異性序列還會干擾下游病原微生物的的判斷。針對這一問題，通常在核酸提取環(huán)節(jié)時去除宿主DNA或者增加測數(shù)據(jù)量的方式來提高病原微生物的檢出。接下來小編跟大家介紹幾個去除宿主DNA的小妙招~

怎么去除宿主DNA？

目前去除宿主DNA的方法主要分為提取DNA前去除和提取DNA后去除。提取DNA前去除包括物理法、生物法、化學法，而提取DNA后去除主要通過抗甲基化DNA磁珠來實現(xiàn)。

1.物理法

該方法基于宿主細胞和微生物細胞大小的差異去除宿主細胞，例如粘膜上皮細胞平均大小為50 μm，而一些典型的細菌細胞一般是1 μm。這種情況下可以采用過濾法去除宿主細胞，或者根據(jù)細胞沉降系數(shù)的差別，利用離心法去除宿主細胞。但是該種方法無法有效去除胞外DNA。

2.生物法

基于微生物和動物細胞結(jié)構(gòu)的不同，選擇性的裂解宿主細胞，利用核酸酶酶解掉釋放出來的宿主DNA，后利用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物，最后純化微生物DNA。或者也可以利用人源細胞的細胞膜較微生物外壁脆弱的特點，在核酸提取前用溫和去污劑（如皂苷）裂解宿主細胞釋放 DNA，再用DNaseⅠ酶解裸露的宿主DNA ，后續(xù)進行微生物DNA提取等操作。該種方法通常可使微生物富集效率提高1000倍[1]。

3.化學法

PMA（疊氮碘化丙錠）是一種可以高效結(jié)合dsDNA的染料，二者結(jié)合后熒光會增強，在可見光的誘導下，PMA分子的疊氮化物基團被光解并發(fā)生C-H插入反應并與DNA形成共價鍵，從而產(chǎn)生恒久性的DNA修飾，從而使DNA的片段化。由于這種染料無法通過功能完整的細胞膜，所以其可以標記裸露在外的DNA。該種方法先利用低滲溶液破壞人源宿主細胞，后利用PMA去除宿主DNA，后結(jié)合用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物，最后提取微生物DNA[2]。

4.抗甲基化DNA磁珠

在原核生物中，DNA甲基化主要發(fā)生在腺嘌呤堿基（A）上，在真核生物中，DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶堿基（C）上，人類基因中有90%以上的CpG位點被甲基化修飾。該方法先提取全部的DNA，利用帶有蛋白A修飾的磁珠，通過MBD2-Fc蛋白媒介，與宿主DNA中甲基化的CpG位點特異結(jié)合，可有效去除高達98%的甲基化宿主DNA，從而針對性的去除真核生物中常見的甲基化的核苷酸序列，可實現(xiàn)3~5倍富集[3]。

如果某些微生物甲基化模式和宿主類似，在去除宿主DNA時也會被去除。

上述就是病原微生物提取公司分享的病原微生物提取方法的相關(guān)內(nèi)容，對此你還有什么不了解的，歡迎前來咨詢我們網(wǎng)站，我們會有技術(shù)人員為你講解。

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