通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行PBMC表型分析

時(shí)間：2023-10-23作者：西安百螢生物科技有限公司瀏覽：32

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行 PBMC（外周血單核細(xì)胞） 分析可廣泛應(yīng)用于研究和臨床研究，包括 HIV 研究、癌癥和基于細(xì)胞因子的反應(yīng)的基礎(chǔ)研究。PBMCs通常通過(guò)密度梯度離心或磁珠分離從外周血、骨髓和臍帶中提取。這些方法旨在將白細(xì)胞與紅細(xì)胞 (RBC) 等其他細(xì)胞成分分離。

流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)常見(jiàn)應(yīng)用是 PBMC 表型分析。該技術(shù)測(cè)量被稱為“分化簇”(CD) 標(biāo)記的細(xì)胞表面分子的表達(dá)，以識(shí)別、區(qū)分和表征 PBMC 亞群。除了 CD 標(biāo)記表達(dá)之外，計(jì)數(shù)和細(xì)胞大小的監(jiān)測(cè)對(duì)于該分析也至關(guān)重要。其中一個(gè)例子是嵌合抗原受體 T (CAR-T) 細(xì)胞癌癥領(lǐng)域。

為了表征 PBMC 上的 CD 標(biāo)記，將針對(duì) CD 標(biāo)記的抗體與藻紅蛋白 (PE) 等熒光團(tuán)綴合。然后使用流式細(xì)胞儀測(cè)量熒光強(qiáng)度，以量化 CD 標(biāo)記表達(dá)水平并區(qū)分 PBMC 亞群。本應(yīng)用說(shuō)明演示了用于表征 PBMC 上 CD 標(biāo)記的單熒光團(tuán)和雙熒光團(tuán) PBMC 染色技術(shù)。

 

CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的制備




PBMC 染色：

1. 在標(biāo)記之前，使用臺(tái)盼藍(lán)染料排除測(cè)試（2452）確定 PBMC 活力，每個(gè)樣品使用 100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

2. 用 HHBS 緩沖液（ 20011）通過(guò)離心機(jī)以 1000 RPM 洗滌 PBMC 2 次，每次洗滌 5 分鐘。

3. 為了阻斷非特異性 Fc 介導(dǎo)的相互作用，將 PBMC 重懸于含有 1% BSA 溶液的 HHBS 緩沖液和 Human TruStain FcX? 5 μL/100 μL 檢測(cè)緩沖液中，并在室溫10分鐘。

4. 對(duì)于單熒光團(tuán) PBMC 染色，將 PBMC 與終濃度 0.1 μg 的 CD45-PE、CD45-APC、小鼠 IgG-PE 或小鼠 IgG-APC 在冰上避光孵育 20 分鐘。

5. 對(duì)于雙熒光團(tuán) PBMC 染色，將 PBMC 與 CD45-PE 和 CD4-FITC 以及 CD45-PE 和 CD3-APC 共孵育。所有四種染料的終濃度均為 0.5 μg，在冰上避光保存 20 分鐘。用 Assay Buffer 清洗 PBMC 兩次，然后將 PBMC 重懸于 Assay Buffer 中。

6. 在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。

使用 Buccutite? 綴合技術(shù)生成的綴合物可提供高質(zhì)量的產(chǎn)量。這些綴合物在 PBMC 上進(jìn)行了測(cè)試，并且可以靈活地與其他綴合物組合進(jìn)行多色染色，以檢測(cè) PBMC 中的 CD 標(biāo)記。

         

使用 CD45-PE、CD45-APC、CD4-FITC 和 CD3-APC 使用單熒光團(tuán)和雙熒光團(tuán)對(duì) PBMC 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。密度圖（左邊）用于從其他細(xì)胞群中排除淋巴細(xì)胞。直方圖（右上）和密度圖（右下）分別用于單次和多次熒光團(tuán)染色。數(shù)據(jù)記錄在 ACEA Biosciences 的 NovoCyte 3000 流式細(xì)胞儀上，并使用 NovoExpress 1.2.5 版進(jìn)行分析。


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