DNA序列分析軟件Sequencher的Next-Generation Sequencing功能

時間：2023-08-30作者：北京環(huán)中睿馳科技有限公司瀏覽：24

Gene Codes致力于為您帶來在**評審期刊上開發(fā)和發(fā)布的各種比對和組裝算法，但讓非工程師也可以使用它們。例如，GSNAP（Tom Wu，Genentech，Inc.）被認為是正確識別剪接點的算法之一。生物信息學可能會像這樣調(diào)用該程序：










如果我們有一些工具來幫助我們了解所有可用的標志和參數(shù)是什么以及它們?nèi)绾斡绊懗绦?，那么我們大多?shù)人的工作效率都會高。Sequencher界面可幫助您選擇選項、設(shè)置值并通過說明和工具提示了解可用功能。上面指令行中的相同選項在Sequencher中設(shè)置如下：










只需幾個步驟即可執(zhí)行SNP分析、甲基化分析或RNA A-to-G耐受比對。




在平板電腦中查看您的結(jié)果 。




BWA、Velvet、Maq、GSNAP和Tablet只是Sequencher的開始。如果您要對混合群體進行測序，請將參考引導比對與從頭組裝的力量結(jié)合起來。將讀數(shù)與參考比對并捕獲未比對的讀數(shù)，以進行進一步的基于參考的比對或從頭組裝。










通過添加Cufflinks套件，您可以使用我們?yōu)樗蠳GS算法開發(fā)的相同風格的界面來執(zhí)行RNA-Seq差異表達。










我們還添加了您期望看到的圖表，例如火山圖，因此您*借助指令行即可查看結(jié)果。因為我們知道您有自己喜歡的矯正器，所以我們不會堅持您使用我們的。只要您的對齊器創(chuàng)建SAM或BAM作為其輸出，您就可以使用廣泛認可的RNA-Seq工具之一來探索您的數(shù)據(jù)。










FastQC質(zhì)量控制報告




在開始調(diào)整數(shù)據(jù)之前，請停下來考慮一下。您不想知道您的數(shù)據(jù)有多好嗎？好吧，現(xiàn)在您可以使用FastQ質(zhì)量報告。我們已將流行的FastQC程序集成到Sequencher中。從“序列”>“分析”>“FastQ質(zhì)量報告...”啟動，您可以獲得多達12個不同指標的結(jié)果。從“每堿基序列質(zhì)量”到“Kmer內(nèi)容”，從“序列重復(fù)水平”到“過度代表性序列”，結(jié)果以易于理解的交通燈系統(tǒng)以及詳細的圖形形式呈現(xiàn)。







每個報告都顯示在自己的窗口中，以便您可以并排查看它們。使用報告在組裝之前監(jiān)控數(shù)據(jù)集的單獨質(zhì)量或隨著時間的推移監(jiān)控質(zhì)量。




RNA測序




RNA-Seq實驗為蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的研究帶來了新的理解和知識，無論是來自不同時間點的正常組織還是正常與生病狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)錄本。Sequencher插件家族的新成員是Cufflinks套件 ，一系列專為研究RNA-Seq NGS數(shù)據(jù)而設(shè)計的程序。入門再簡單不過了。




使用您喜歡的比對器將您的RNA-Seq NGS數(shù)據(jù)與參考序列比對，然后獲取生成的SAM或BAM文件以及參考GTF文件以開始使用 Cufflinks。




關(guān)鍵是利用Cufflinks、Cuffmerge、Cuffdiff的四步過程進行差異表達，然后將數(shù)據(jù)顯示為表格和繪圖。Cufflinks套件指令行程序都可以使用我們易于使用的圖形界面進行訪問。為了實現(xiàn)控制，您還可以通過簡單的點擊“高等（編輯）”對話框來訪問所有高等指令行功能。







您可以在Sequencher中運行分析并以繪圖形式查看結(jié)果。通常，差異表達需要您從指令行安裝并使用R統(tǒng)計編程語言。










我們?yōu)槟峁┮粋€菜單指令，允許您使用火山圖、散點圖和條形圖顯示結(jié)果。每個點或條都鏈接到其基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，因此您可以單擊您感興趣的點或條并詳細探索結(jié)果。




Sequencher中的Cufflinks套件現(xiàn)在包括Cuffquant和Cuffnorm。如果您不處理差異表達基因但仍需要標準化結(jié)果，請在 Cufflinks步驟后使用Cuffquant和Cuffnorm。如果您需要減少計算機上的計算負載，可以在Cufflinks和Cuffmerge步驟之后使用 Cuffquant來量化數(shù)據(jù)集中的讀數(shù)。然后，當您準備好時，使用Cuffdiff完成差異分析。您會發(fā)現(xiàn)這一步要快得多，因為那部分工作已經(jīng)完成。













通過基因名稱或基因ID搜索數(shù)據(jù)表，快速找到您感興趣的數(shù)據(jù)。




對數(shù)據(jù)進行排序和篩選，僅繪制您感興趣的數(shù)據(jù)，然后以PNG格式導出圖表以包含在演示文稿或報告中。




De Novo組裝




Velvet在5.1版中加入了不斷壯大的Sequencher插件家族。Velvet是一個從頭匯編器，它不需要參考序列。雖然我們談?wù)揤elvet，但它實際上由兩個程序組成。Velveth準備您的數(shù)據(jù)集，而Velvetg使用一種稱為de Bruijn圖的方法執(zhí)行組裝步驟。Velvetg構(gòu)建重疊群，甚至會嘗試搭建那些無法自行組合在一起的重疊群。




Velvet可以使用Multiplex ID數(shù)據(jù)進行從頭組裝。Sequencher自動按條形碼將數(shù)據(jù)劃分為單獨的文件（箱），然后對齊它們并將結(jié)果放入單獨的結(jié)果文件夾中。然后可以在平板電腦瀏覽器中查看結(jié)果。每個重疊群的共有序列將出現(xiàn)在您的項目窗口中。










Velvet被編寫為在指令行上運行。Sequencher使您只需單擊幾下即可輕松啟動程序集運行，從而保護您免受指令行的影響。高等用戶和新手仍然可以訪問指令行參數(shù)來添加或改參數(shù)，我們引入了一個新的GUI，讓您也可以訪問和利用這些參數(shù)。




參考引導對齊




比對人員花費一部分時間對參考序列進行索引，以加快整體比對速度?，F(xiàn)在，您可以創(chuàng)建并保留這些索引 (BWA) 或數(shù)據(jù)庫 (GSNAP)，當您想要嘗試不同的參數(shù)以改進對齊或拼接位置時，速度會快。




索引和數(shù)據(jù)庫文件是跨平臺的，因此您可以與不同類型計算機上的協(xié)作者共享它們。當您創(chuàng)建新索引或數(shù)據(jù)庫時，它將自動出現(xiàn)在該比對器的可用參考序列列表中，可供隨時使用。Sequencher會記住它的位置，因此您*記住它。




來自預(yù)處理參考的文件可能會變得很大。當您不再使用某個數(shù)據(jù)時，只需使用外部數(shù)據(jù)瀏覽器一鍵刪除即可。您將節(jié)省磁盤空間，并且如果您需要再次索引相同的參考序列，Sequencher可以輕松地重新創(chuàng)建它。




BWA

BWA在5.2版本中加入了Sequencher插件系列。Sequencher使用BWA-MEM，這是BWA軟件包中新、快的算法。BWA-MEM旨在將70bp到1Mbp的序列讀數(shù)與參考比對。




BWA被編寫為在指令行上運行。Sequencher為您提供了一個易于使用的界面，使您*使用指令行，也*學習或使用指令行參數(shù)。對于想要訪問這些指令行功能的高等用戶來說，“高等（編輯）”對話框也可以讓您利用這些功能。










GSNAP

GSNAP在5.0版中加入了Sequencher插件系列。GSNAP通過壓縮參考序列，使用基于參考的對齊方法。這使得GSNAP在執(zhí)行下一代測序時變得快、容易。




GSNAP旨在對雙端和不雙端的Illumina-Solexa或Sanger標準數(shù)據(jù)執(zhí)行基于參考的比對。序列的長度對于GSNAP來說不是問題，因為它能夠輕松對齊很短到任意長的數(shù)據(jù)長度。




GSNAP現(xiàn)在可以處理Multiplex ID (MID) 數(shù)據(jù)，從而進一步很大限度地提高效率?，F(xiàn)在您擁有了Sequencher的用戶友好界面，它允許您通過MID數(shù)據(jù)利用 GSNAP 的功能。Sequencher自動將數(shù)據(jù)按條形碼劃分為單獨的文件，使用GSNAP將這些文件與參考對齊，并將結(jié)果放入單獨的結(jié)果文件夾中。




任意與GSNAP對齊的結(jié)果都可以在流行的平板電腦瀏覽器中查看。










對于想要好地控制GSNAP指令行功能的高等用戶，請按“高等（編輯）”打開“高等GSNAP 選項”對話框，您可以在其中配置特定的指令行參數(shù)。




Maq




Maq在5.0版本中加入了Sequencher插件系列。流行的Maq算法將單端和雙端下一代數(shù)據(jù)與參考序列對齊。開始設(shè)計用于對齊 Illumina-Solexa 數(shù)據(jù)，它將對齊任意很短的讀取數(shù)據(jù)（63個堿基或少）。參考序列可以是FastA或GenBank文件的形式。Maq使用二進制格式來壓縮引用并讀取文件。關(guān)鍵的是，Maq運行所需的RAM很少，這使得執(zhí)行下一代測序變得加容易。它也適用于大約200萬次讀取的小型項目，盡管可以將較大的項目分解然后稍后合并結(jié)果。




比對結(jié)果可以在Maqview或Tablet中查看。










Maq開始是為了在指令行上運行而編寫的。Sequencher 提供了一個簡單、易于使用的界面，可以保護您免受指令行的影響，也不必學習如何使用指令行參數(shù)。




使用SAMtools進行變體調(diào)用




您已經(jīng)對它進行了測序，現(xiàn)在您已經(jīng)對其進行了對齊。接下來使用新的變體調(diào)用功能檢查變體的比對。無論您是使用我們的參考引導比對器之一比對讀數(shù)，還是在其他地方獲取比對的SAM/BAM文件，您仍然可以使用SAMtools的變體調(diào)用來檢查變體。




該分析可以在SNP耐受比對、甲基化耐受比對或GSNAP中新的RNA A-to-I編輯耐受模式之后使用。然后將生成的VCF文件和 SAM文件加載到您喜歡的瀏覽器中（如果您沒有試用平板電腦）——它是我們DNA-Seq工具發(fā)行版的一部分。向平板電腦提供GTF文件進行注釋，您還可以看到功能中的變體。










Multiplex ID




Sequencher 5.2及高版本使用BWA、GSNAP或Velvet的從頭或基于參考的組裝的復(fù)用方法。多路復(fù)用既快速又簡單。每個 DNA樣本都有一個與其相關(guān)的特定條形碼。Sequencher可以讀取這些條形碼并將數(shù)據(jù)劃分到各種文件或“容器”中。然后，Sequencher獲取每個“bin”中的序列并為您執(zhí)行組裝或比對。Sequencher的Multiplex ID可與單端或雙端數(shù)據(jù)一起使用。對于成對末端數(shù)據(jù)，成對中的每個讀取都必須在 5' 端具有相同的條形碼才能被識別為成對。您可以使用平板電腦查看器查看多重組裝或比對的結(jié)果。










SNP分析

在尋找候選SNP時，篩選下一代測序產(chǎn)生的數(shù)百萬條讀數(shù)是一項重大挑戰(zhàn)。Maq和GSNAP算法都包含SNP篩選功能。




Maq有一個兩級篩選過程，首先搜索讀數(shù)和參考序列之間的差異。接下來，進行過濾步驟，篩選初始結(jié)果，尋找每列讀數(shù)的同一類別的小數(shù)量的變體，以及嵌入高質(zhì)量區(qū)域的變體。結(jié)果以綜合報告形式呈現(xiàn)。您還可以在Maqview或平板電腦中查看結(jié)果。




通過GSNAP，SNP分析采用不同的方法來查看先前報告的SNP以及新的候選者。用戶必須提供已知SNP的列表以及讀數(shù)和參考序列。GSNAP對所有主要和次要等位基因執(zhí)行SNP耐受比對。該算法能夠區(qū)分次要等位基因和不匹配。結(jié)果以綜合報告形式呈現(xiàn)。您還可以在平板電腦中查看結(jié)果。










Methylation Studies

幾十年來，DNA甲基化一直被認為在基因表達中發(fā)揮著重要作用。當DNA用亞硫酸氫鹽處理時，任意胞嘧啶都會轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，除非胞嘧啶已被甲基化。GSNAP將從亞硫酸氫鹽處理的DNA測序中獲取的下一代測序讀數(shù)與參考序列進行比對，其比對方式不會掩蓋真正的錯配，但仍會暴露用亞硫酸氫鹽處理未甲基化DNA時發(fā)生的C到T錯配。










RNA耐受比對

GSNAP已新，現(xiàn)在包含A到G的容忍對齊模式。如果您的mRNA可能已被ADAR基因編輯，導致腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷，請使用此模式。測序時I被視為G。




該版本還引入了鏈鏈和非鏈模式，用于新的RNA耐受模式和甲基化分析。當您的實驗室方案允許 5' 到 3' 基因組讀取及其每條鏈上的反向互補時，請使用非鏈模式。










Viewers

Tablet是用于下一代序列比對的高性能查看器。在多種不同模式下查看和檢查您的Maq、GSNAP、BWA-MEM或Velvet結(jié)果，以不同顏色**顯示堿基并讀取方向。獲取有關(guān)單個讀數(shù)和讀數(shù)對的信息，并安排讀數(shù)的堆疊以揭示配對。平板電腦具有用于啟用翻譯、放大和縮小以及**顯示變體堿基的控件，使您可以輕松探索閱讀內(nèi)容。




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