全自動(dòng)核酸提取純化系統(tǒng)給您好的建議「在線咨詢」

時(shí)間：2020-03-01作者：廣州勱博儀器有限公司瀏覽：69

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在PCR擴(kuò)增中，溶液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。

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直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光，分子信標(biāo)（molecular beacon）就屬于這一類，它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針?lè)肿映拾l(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí)，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光。如采用常規(guī)的終點(diǎn)檢測(cè)法（利用EB染色來(lái)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量），即使起始模板量相同經(jīng)PCR擴(kuò)增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)度。




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QF-PCR技術(shù)在國(guó)外已有較廣泛的應(yīng)用，但目前尚未在國(guó)內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開(kāi)展。為規(guī)范使用QF-PCR技術(shù)，由國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委i員會(huì)召集、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心主辦的"全國(guó)產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)管理規(guī)范編制研討會(huì)"于2015年11月14日在成都召開(kāi)，會(huì)議就QF-PCR等快速產(chǎn)前診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用進(jìn)展及其在國(guó)內(nèi)應(yīng)用中存在的具體問(wèn)題進(jìn)行了深入而廣泛的探討，并形成了QF-PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用*共識(shí)。在real-timeQ-PCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。

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熒光定量PCR較早稱TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理： 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。在real-time技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè) 產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。?




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隨著定量PCR儀設(shè)計(jì)上的不斷改進(jìn)，對(duì)溫度控制的精密性越來(lái)越高，出現(xiàn)了像Rotor-Gene這樣的管間溫度均一性達(dá)±0.01℃的定量PCR儀，而該公司新近推出的Rotor-Gene6000較可達(dá)到±0.02℃的溫度分辨率。溫度上的高分辨率使得運(yùn)用定量PCR儀進(jìn)行高分辨率熔解曲線（HRM）分析基因型成為可能。高分辨率熔解曲線根據(jù)序列長(zhǎng)度、GC含量和互補(bǔ)性分析樣品。另外，熒光定量PCR的結(jié)果*通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)評(píng)估，大大節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。不同的核酸序列，哪怕僅有一個(gè)堿基的差異，也會(huì)體現(xiàn)在熔解溫度的差別上。

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PCR是1985年開(kāi)始出現(xiàn)的一項(xiàng)基因檢測(cè)技術(shù),由于PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)便易行、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究,成為分子生物學(xué)**的研究工具。但在許多情況下,研究者們已不再滿足于得知某一特異DNA序列的存在與否,他們較著眼于對(duì)其進(jìn)行精i確的核酸定量。因而,借助PCR對(duì)基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確的定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。二、應(yīng)急期間，比對(duì)符合要求的檢測(cè)試劑盒（試紙條）可使用至2019年6月30日。實(shí)時(shí)熒光定量PCR( real-time quantitative PCR, RQ PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。




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