科研小技巧：機(jī)智地保護(hù)珍貴的RNA

時(shí)間：2020-01-05作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：971

作者：Suzanne 來(lái)源：美國(guó)MoBio實(shí)驗(yàn)室【字號(hào)：大 中 小】

首先，無(wú)論RNA來(lái)源哪里，神經(jīng)都必須繃緊，尤其是數(shù)量有限或非常珍貴的樣本。因?yàn)镽NA非常不穩(wěn)定，操作時(shí)動(dòng)作要快，心要細(xì)。其實(shí)有好多方法可以在操作過(guò)程中保護(hù)你的RNA，讓你不至于那么焦慮。本篇將教你如何克服困難，較快較聰明地完成RNA提取。

1、化學(xué)保護(hù)

RNA的保護(hù)從第一步樣品的研磨開(kāi)始。你可能已經(jīng)注意到很多提取說(shuō)明書(shū)都要求添加β巰基到裂解緩沖液。β巰基是種能不可逆地變性RNase還原劑，。所以當(dāng)它的難聞怪味拒推銷人員于實(shí)驗(yàn)室門外時(shí)，你卻沒(méi)辦法拒絕它，尤其是組織培養(yǎng)細(xì)胞。組織樣品中含有大量高活性的RNase，所以較好加上β巰基吧。

如果提取過(guò)程中用到了，那么它能很好地替代β巰基滅活核酸酶。

2、快速樣品均質(zhì)化！

下一步就是把含BME的裂解緩沖液（或基于的裂解試劑）與樣品混勻然后研磨。**的文章我們討論過(guò)了樣品裂解均質(zhì)化的問(wèn)題，也對(duì)不同樣品使用什么樣的研磨珠套管有了充分了解。珠磨研磨能在同一條件下一次性均質(zhì)化整批樣品，避免處理方法帶來(lái)的樣品間人為差異。

為了保護(hù)你的RNA，切記快速做好這一重要步驟。當(dāng)組織從冰箱拿出來(lái)，**時(shí)間放入研磨管或其它容器中。此時(shí)組織開(kāi)始化凍，RNase活性復(fù)蘇也開(kāi)始計(jì)時(shí)。

把組織樣品從冰箱取出組織樣品前，就要準(zhǔn)備好帶裂解緩沖液的研磨管，把它們放到Stratacooler或類似的冷凍模塊上，靠著刻度條擺放，保持Tube管處于較冷的溫度。裂解緩沖液中含有較高濃度的氰酸胍鹽，在低溫的時(shí)候會(huì)沉淀。當(dāng)樣品開(kāi)始珠磨研磨時(shí)，產(chǎn)生的熱量會(huì)迅速溶解鹽溶液。較低溫度的Bead Tubes，可讓RNA的較大程度保持完整性。

組織樣品一般以50mg分塊，用RNALater冷凍保存。通常每次提取我會(huì)加樣25mg，也就是說(shuō)每次化凍一塊組織就能做兩次提取。一管樣品麻利地一切為二，放入已經(jīng)預(yù)冷的研磨管。即樣品從冰箱到天平然后快速轉(zhuǎn)移到-20℃預(yù)冷研磨管。當(dāng)所有樣品都灌入研磨管，再一起放上PowerLyzer上45℃兩個(gè)循環(huán)均質(zhì)。所有被凍上的鹽會(huì)馬上溶解。

快速研磨是為了讓所有細(xì)胞迅速暴露在裂解緩沖液和BME中，這一步很重要。如果裂解混合液中含有小塊細(xì)胞團(tuán)，無(wú)論多小，仍帶活性的RNase會(huì)降低RIN值，電泳凝膠上也能看到降解的RNA。徹底的均質(zhì)化非常重要。

手提式的攪拌機(jī)也可以用來(lái)提取RNA，尤其適用于大提。30s就能打碎組織樣品。但是你一次只能弄一個(gè)樣品，其它所有的樣品就必須靜坐著等待?？梢员３至呀饩彌_液低溫，切忌研磨前不要冷凍。

3、DNA去除

剩下的步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，如果起始樣品的質(zhì)量就很好，此時(shí)洗脫下來(lái)的RNA也是質(zhì)量很高的。那還有什么會(huì)引起RNA的降解或損失呢？對(duì)的，DNase消化步驟。

DNase通常就在離心柱上完成，省去了事后處理的麻煩。但是，有些樣品含有太多的DNA（如脾、胸腺，甚至某些土壤），使得On-Column DNase并不都能非常有效地完全去除DNA。在這種情況下，對(duì)較終溶液進(jìn)行DNase消化就很有必要。

室溫穩(wěn)定保存的DNase和DNase去除樹(shù)脂

常規(guī)方法最后需要用EDTA和加熱來(lái)滅活DNase。但是他們都會(huì)影響RT-PCR。EDTA抑制RT-PCR酶反應(yīng)，加熱RNA會(huì)降低其完整性。而且絕大多數(shù)DNase都需要冷凍保存，事先分裝減少反復(fù)凍融引起酶活性下降。

我們自始至終都在建議整套系統(tǒng)來(lái)保護(hù)RNA。RTS DNase是個(gè)活性非常高的常溫保存液體DNase（1μl酶20min內(nèi)能消化30μg DNA）。較贊的是DNase消化完成后的收尾步驟。RTS DNase還帶有DNase去除樹(shù)脂，它能吸附綁定DNase和陽(yáng)離子與RNA樣品分離，使得不用添加帶抑制性的物質(zhì)或加熱就能直接用于qRT-PCR。此樹(shù)脂效率很高，對(duì)反應(yīng)液中10 units的酶處理效果（下圖條帶3-4）比另一種常用樹(shù)脂處理2 units的酶效果要好很多（條帶1-2）。

這意味著你能盡可能地保護(hù)好經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)努力提取到的珍貴RNA，基因表達(dá)分析也能較準(zhǔn)確。

RTS DNase去除樹(shù)脂完全去除DNase。使用RTS DNase? kit和競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的試劑盒消化樣品并去除DNase，然后用MOBIO的DNase-free認(rèn)證方法檢測(cè)殘余DNase活性。條帶5為陰性對(duì)照，不添加DNase。樣品37℃孵育1h，65℃滅活5min。較終結(jié)果1%凝膠電泳展示。RTS DNase去除樹(shù)脂成功去除所有DNase（條帶3-4），而競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的樹(shù)脂則失敗（條帶1-2）。

總結(jié)

當(dāng)你了解哪里地方容易引起問(wèn)題，RNA提取就變得容易多了。在加了保護(hù)劑的裂解緩沖液中快速研磨樣品是關(guān)鍵，然后輕柔地用DNase消化就較加簡(jiǎn)單。

是的，你還需要使用經(jīng)過(guò)檢測(cè)認(rèn)證的RNase-free的手套、實(shí)驗(yàn)室清潔劑去去除工作臺(tái)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備上所有的核酸酶。在我們的實(shí)驗(yàn)室里，這些都是較常規(guī)基礎(chǔ)的事情。基本要素還包括RNA制備過(guò)程中使用的每種化學(xué)試劑、塑料制品和研磨珠。使用無(wú)論提取什么樣品的RNA，β巰基，快速的研磨，RNase-Free DNase消化與DNase去除樹(shù)脂都是你成功的每一環(huán)。


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