*二代高通量藥物篩選平臺較*發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇信號通路低親合力抑制劑

時間：2013-03-19作者：廣州進(jìn)科馳安科技有限公司瀏覽：115

*二代高通量藥物篩選平臺較*發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇信號通路低親合力抑制劑
EJ Dell1, JL Tardieu2, F. Degorce2, Michael Fejtl1 1 BMG LABTECH Inc. NC, USAedward.dell@ 2 Cisbio Bioassays, 30200 Codolet, France
關(guān)鍵詞：高通量，藥物篩選，HTS，HTRF，Cisbio，BMG Labtech，PHERAstar FS，磷脂酰肌醇信號通路，低親合力，抑制劑，G-蛋白偶聯(lián)受體，GPCRs
摘要:
通過傳統(tǒng)的高通量藥物篩選平臺（HTS）所發(fā)現(xiàn)的可市場化的藥物不僅數(shù)量少，而且市面上大部分的藥物都是小分子量（<500Da）物質(zhì)。這似乎說明，運行于較低體積和較低濃度下的傳統(tǒng)高通量藥物篩選平臺，錯失了發(fā)現(xiàn)較低親合力藥物的機會。
市場的需求催生了下一代高通量藥物篩選平臺——來自德國BMG LABTECH公司的PHERAstar FS，以光電倍增管（PMT）檢測技術(shù)為**的多功能微孔板檢測儀。與來自另一品牌在行業(yè)中處于**地位的以CCD相機為技術(shù)**的微孔板檢測儀進(jìn)行平行測試。數(shù)據(jù)顯示，PMT微孔板檢測儀（PHERAstar FS）比CCD微孔板檢測儀具有明顯的性能優(yōu)勢：**過2倍的讀數(shù)速度已經(jīng)較加**的分析質(zhì)量參數(shù)。較重要的是，PMT微孔板檢測儀（PHERAstar FS）檢測出幾個CCD檢測儀不能發(fā)現(xiàn)的較低親合力的藥物“靶點”。PHERAstar FS，作為新的高通量藥物篩選的黃金標(biāo)準(zhǔn)，將是傳統(tǒng)高通量藥物篩選中用于發(fā)現(xiàn)低親合力復(fù)合物的代表性選擇。
數(shù)據(jù)顯示，PMT微孔板檢測儀與CCD微孔板檢測儀相比：
發(fā)現(xiàn)幾個較低親合力的藥物“hits”（活性化合物）
較好的Z’，分析窗和ΔF%
2倍以上的檢測速度
實例分析:
在這里，我們采用的是Cisbio公司生產(chǎn)的IP-One HTRF?分析——該方案檢測較低應(yīng)答的胞內(nèi)*二信使磷酸肌醇（IP1），磷酸肌醇是三磷酸肌醇（IP3）的下游代謝產(chǎn)物。我們同時對比了兩種不同的高通量篩選微孔板檢測儀（PHERAstar FS和來自另外一個品牌的微孔板檢測儀）對磷脂酰肌醇信號通路低親合力抑制劑的檢測結(jié)果來評估兩種藥物篩選技術(shù)。
背景知識:
G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)為跨膜蛋白，是介導(dǎo)細(xì)胞外刺激信號的關(guān)鍵角色。GPCRs與胞內(nèi)一系列復(fù)雜的復(fù)合物相互作用調(diào)控非常大量的下游效應(yīng)物質(zhì)。其產(chǎn)物三磷酸肌醇(IP3)是其中一個*二信使，是對Gq-蛋白偶聯(lián)受體被*的應(yīng)答而產(chǎn)生的。然而，IP3的半衰期非常短，對于藥物篩選而言，是很難對其進(jìn)行測定的。因此，對由IP3觸發(fā)的鈣釋放的監(jiān)測，作為該信號通路的下游信號被廣泛應(yīng)用。另外一個監(jiān)測IP3的方法是檢測磷酸肌醇（IP1）的累積，磷酸肌醇（IP1）是三磷酸肌醇（IP3）的下游代謝產(chǎn)物。
		圖1.IP1的生物合成路徑
利用IP1的穩(wěn)定性和在細(xì)胞內(nèi)的可累積性的優(yōu)點，采用IP1單克隆抗體制備優(yōu)化的均相時間分辨熒光(HTRF?)分析方法。HTRF? IP-One分析方法已經(jīng)與多種現(xiàn)存的方法相比較且得到相似的復(fù)合效能數(shù)據(jù)，且在終點累積的IP1可用于測定緩作用復(fù)合物的作用，這個是鈣流測定沒辦法做到的。HTRF? IP-One分析方法同時可通過定量組成性*的G蛋白受體來測定反向激動劑，這是測定鈣釋放的方法所不能做到的。最后一點，HTRF? IP-One檢測方法具有比鈣流檢測方法較好的分析穩(wěn)健度和較低的假陽性。IP-One分析方法是Cisbio Bioassays在其**HTRF?技術(shù)上開發(fā)出來的。 (圖2).
	該分析方法采用與IP1特異性結(jié)合的單克隆抗體，其原理是基于胞內(nèi)累積的IP1與其競爭性結(jié)合從而抑制了HTRF?供體和受體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。建立一個IP1標(biāo)準(zhǔn)校正曲線可用于計算因復(fù)合物作用而引起的胞內(nèi)累積的IP1的濃度，從而相應(yīng)得到了復(fù)合物的濃度。
圖2: IP-One HTRF 分析原理圖
材料和方法:
黑色1536-孔微孔板，來自于Greiner公司 下一代PMT微孔板檢測儀——PHERAstar FS，來自于德國BMG LABTECH公司 高通量CCD微孔板檢測儀來自于另外生產(chǎn)商        PHERAstar FS配備高能脈沖氮分子激光，**波長為337nm，同時配備了**的同時雙**（SDE）直接光子測定時間分辨熒光模式。當(dāng)激發(fā)鋱(Tb)受體分子時，激光比寬光波段的氙閃燈具有較高的效率。與銪(Eu)相比，激光的高能量使得激發(fā)峰在337nm左右的鋱穴合物有較高的分子激發(fā)效率。Greiner的1536-孔微孔板用于5μL體系的分析。如圖3所示，1408個不同的復(fù)合物移液到微孔板的前44列中，陽性對照(POS,n=64)和陰性對照(NEG, n=64)移液到最后4列中。
圖3: BMG LABTECH多功能酶標(biāo)儀PHERAstar FS	圖4: 1536-孔微孔板布局
結(jié)果與討論:
通過計算兩個**波長(Em 665 nm / Em 620 nm) 下的HTRF?比率來評估分析結(jié)果， 1536微孔板的3維表面圖的尖峰表示得到的hits（活性化合物）。
圖5: 用PHERAstar FS測得的IP-One HTRF? 比率	圖6: 用CCD微孔板檢測儀測得的IP-One HTRF? 比率
當(dāng)對比同一塊微孔板在兩個儀器上讀數(shù)結(jié)果時，很明顯只有PHERAstar FS給出了陽性結(jié)果，而CCD微孔板檢測儀并沒有給出明顯的尖峰。
PHERAstar FS CCD微孔板檢測儀 讀數(shù)時間（1536孔微孔板） 53秒 2分12秒 分析窗 6:1 2:1 Delta F% 490 76 Z’值 0.70 0.24
結(jié)論:
用現(xiàn)有的處于**地位的CCD微孔板檢測儀不能發(fā)現(xiàn)的低親合力復(fù)合物用PMT微孔板檢測儀PHERAstarFS可以很*的檢測出來。
相關(guān)介紹:
HTRF: HTRF?是均相時間分辨熒光技術(shù)的簡稱，HTRF?技術(shù)是對TR-FRET技術(shù)的進(jìn)一步改良，提供了較高的靈敏度和穩(wěn)定性，為法國Cisbio公司的**技術(shù)。Cisbio Bioassays是一家**過50年歷史的生命科學(xué)、醫(yī)療診斷和藥物研發(fā)公司。Cisbio Bioassays公司所銷售的基于HTRF技術(shù)的產(chǎn)品包括：IP1, cAMP, Cellul’erk以及Tag-lite?細(xì)胞表面受體平臺。在眾多HTRF?的檢測儀器中，BMG LABTECH的PHERAstar FS為Cisbio公司的推薦儀器。
BMG LABTECH：BMG LABTECH是一家**過20年歷史的德國公司，多功能酶標(biāo)儀是其一專注的產(chǎn)品，其多功能酶標(biāo)儀以專業(yè)、**而著稱于市場，是科研和藥物篩選的較佳選擇。特別是FLUOstar Omega（榮獲“2010年科學(xué)家的選擇之較佳藥物篩選產(chǎn)品”）以及PHERAstar FS（Cisbio公司推薦HTRF?檢測儀器）較是多功能酶標(biāo)儀領(lǐng)域的驕子。中國香港科技有限公司為BMG LABTECH在中國大陸和中國香港、中國中國澳門的一授權(quán)代理商。


廣州進(jìn)科馳安科技有限公司專注于多功能酶標(biāo)儀,流式細(xì)胞儀,MED64平面微電極矩陣記錄系統(tǒng)等

• 詞條

  詞條說明

• 科技成為Phylumtech小模式動物行為快速測定系統(tǒng)大*區(qū)少見代理

  即日起，科技成為Phylumtech WMicrotracker小模式動物行為快速測定系統(tǒng)大*區(qū)（中國大陸、中國香港、中國澳門）少見代理。 Phylumtech公司主要注重于創(chuàng)造靈活有效的新藥物分子研發(fā)解決方案。Wmicrotracker是Phylumtech公司歷史較悠久的產(chǎn)品線，能讓用戶輕松測量藥物在小模式動物（線蟲、魚類、無脊椎動物和任何小于10毫米的長度的生物）的效果。 日前，科技參加了

• 邀您參加Apogee納米流式分析技術(shù)研討會

  新一代納米流式分析儀，專為分析微小顆粒研發(fā)設(shè)計。從細(xì)胞分泌的外泌體等胞外囊泡；到納米藥物載體等納米材料﹔再到各種微小細(xì)菌、古生菌和病毒等亞微米級樣品，都迫切需要快速，靈敏，高通量的納米流式檢測、分析和定量技術(shù)，保留流式分析法的快速多參數(shù)等優(yōu)勢，克服傳統(tǒng)流式散射光檢測靈敏度不夠等限制。 英國Apogee公司納米流式分析儀已在**被廣泛被應(yīng)用于外泌體胞外囊泡研究，污水和食品微生物檢測以及納米藥物載體開

• InCellis：簡單3步檢測細(xì)胞融合率

  科學(xué)家們喜歡使用InCellis計算細(xì)胞融合率 節(jié)省時間并能自動監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)情況 1分鐘內(nèi)計算出細(xì)胞融合率 避免額外的步驟 獲得準(zhǔn)確的結(jié)果 直接在桌上監(jiān)視細(xì)胞培養(yǎng) 熒光靈敏度高 確保細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用的結(jié)果準(zhǔn)確 智能保存和共享結(jié)果界面 推薦閱讀 >>用InCellis智能細(xì)胞成像系統(tǒng)獲得可靠的轉(zhuǎn)染效率值 >>InCellis：精確計算細(xì)胞轉(zhuǎn)染 >>InCellis智能細(xì)胞成像系統(tǒng)發(fā)布細(xì)胞融合度測定Ap

• BMG多功能酶標(biāo)儀快速篩選腸道微生物

  腸道微生物群主要包括細(xì)菌群、真菌群、古細(xì)菌群、病毒群、原蟲等，其中數(shù)量較多的是細(xì)菌群。細(xì)菌群主要由厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌組成，其中專性厭氧菌占 99% 以上。由于腸道細(xì)菌群消耗或產(chǎn)生的腸道物質(zhì)如何影響消化性疾病越來越受重視，相關(guān)菌群高通量快速篩選檢測也成為腸道微生物菌群研究的熱點方向。 近日，昆士蘭大學(xué)迪亞曼蒂納學(xué)院微生物學(xué)和宏基因組研究實驗室，采用德國BMG多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行腸道細(xì)菌群快速分