百螢鈣離子指示劑BAPTA,四鈉鹽實驗方案

時間：2024-03-01

一．百螢鈣離子指示劑BAPTA,四鈉鹽參數(shù)

Ex(nm)	--
Em(nm)	--
分子量	564.36
溶劑	Water
存儲條件	在-15℃以下保存，避光防潮

二．百螢鈣離子指示劑BAPTA,四鈉鹽簡介

BAPTA（1,2-雙（鄰氧基）乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸）是一種水溶性且細胞不可滲透的鈣螯合劑。它對鈣具有高選擇性。BAPTA是鈣特異性的基聚羧酸。四個羧酸官能團的存在使得兩個鈣離子的結(jié)合成為可能。羧酸鹽配體的廣泛柔韌性對于鈣和其他金屬離子的配位至關(guān)重要。

三．百螢鈣離子指示劑BAPTA,四鈉鹽

鈣指示劑AM Esters的使用

1.帶有鈣指示劑AM酯：

AM酯是非性酯，很穿過活細胞膜，并被活細胞內(nèi)的細胞酯酶水解。酯被廣泛用于無創(chuàng)地將各種性熒光探針裝載到活細胞中。但是，使用AM酯時特別注意，因為它們易于水解，特別是在溶液中。它們應(yīng)該用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）進行重構(gòu)。DMSO儲備溶液應(yīng)在-20°C的干燥環(huán)境中保存，并避光。在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。

以下是我們的將AM酯加載到活細胞中的方案。該協(xié)議僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的特定需求進行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯儲備溶液。

b）在實驗當(dāng)天，將固體的鈣指示劑溶解在DMSO中，或?qū)⒌确值闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝?。在您選擇的含0.04％Pluronic?F-127的緩沖液（例如Hanks and Hepes緩沖液）中，準備2至20 μM的工作溶液。對于大多數(shù)細胞系，我們建議鈣指示劑的終濃度為4-5 uM。根據(jù)經(jīng)驗確定細胞加載所需指示劑的確切濃度。為避免因過載和潛在的染料毒性而導(dǎo)致的任何偽影，建議使用可以產(chǎn)生足夠信號強度的小探針濃度。

c）如果您的細胞（例如CHO細胞）中含有陰離子蛋白，則可以將丙磺舒（2–5 mM）或亞砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（孔濃度為1）丙磺舒為-2.5 mM，亞磺酰吡嗪為0.1 -0.25 mM，以減少去酯化指示劑的泄漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）添加到細胞板中。

e）在溫度或37°C下將染料加載板室孵育20分鐘（尤其是Fluo-8 AM）至2小時，然后在室溫下將板孵育30分鐘。

注1：降低加載溫度可能會減少指示器的分隔。

注2：將Cal-520 AM孵育2小時以上，對于某些細胞系會產(chǎn)生好的信號強度。

f）用HHBS或您選擇的緩沖液（包含陰離子蛋白抑制劑，如1 mM丙磺舒，如果適用）替換染料工作溶液，以除去過量的探針。

g）在所需的Ex / Em波長下運行實驗。

2.測量細胞內(nèi)鈣響應(yīng)：

為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是實驗鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。

解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。與校準溶液相比，熒光指示劑的Ca結(jié)合和光譜性質(zhì)在細胞環(huán)境中變化非常顯著。細胞內(nèi)指標(biāo)的原位反應(yīng)校準通常產(chǎn)生顯著體外測定的Kd值。通過在離子載體如A-23187,4-A-23187和離子霉素存在下將加載的細胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進行原位校準。或者，細胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細胞外培養(yǎng)基的受控Ca2+水平。

詞條
詞條說明
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