百螢問答之鬼筆環(huán)肽Phalloidin實(shí)驗(yàn)過程是怎樣的

時(shí)間：2024-01-12作者：西安百螢生物科技有限公司瀏覽：45

一.百螢 鬼筆環(huán)肽Phalloidin概述




鬼筆環(huán)肽是一種雙環(huán)七肽毒素，特異性結(jié)合在F-肌動(dòng)蛋白亞基之間的界面上，將相鄰的亞基鎖定在一起。鬼筆環(huán)肽與肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)合比與肌動(dòng)蛋白單體的結(jié)合要緊密得多，從而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白亞基從絲端解離的速率常數(shù)降低，因此通過防止絲解聚而基本穩(wěn)定了肌動(dòng)蛋白絲，終，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽抑制F-肌動(dòng)蛋白的ATP水解活性。因此，鬼筆環(huán)肽以不同于G-肌動(dòng)蛋白的構(gòu)型捕獲肌動(dòng)蛋白單體，并通過大大降低單體解離的速率常數(shù)來穩(wěn)定F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)。鬼筆環(huán)肽在細(xì)胞中不同濃度下的功能不同，當(dāng)以低濃度引入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，鬼筆環(huán)肽將聚合度較低的胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白和纖維蛋白吸收到聚集的肌動(dòng)蛋白聚合物的穩(wěn)定“島”中，但它不會(huì)干擾應(yīng)力纖維，即厚的微絲束。鬼筆環(huán)肽的性質(zhì)是研究F-肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞中分布的有用工具，方法是用熒光類似物標(biāo)記鬼筆環(huán)肽并將其用于染色肌動(dòng)蛋白絲以進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已被證明在定位活細(xì)胞或固定細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲以及體外觀察單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲方面非常有用。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作高分辨率研究肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的重要工具。




二. 百螢 鬼筆環(huán)肽Phalloidin參數(shù)

Ex(nm)    --

Em(nm)    --

分子量    788.88

溶  劑    DMSO

存儲(chǔ)條件   在零下15℃以下保存，避光防潮

 

三.百螢 鬼筆環(huán)肽Phalloidin實(shí)驗(yàn)方案

樣品分析方案

概述

在微孔板孔中制備樣品

從板中的樣品中取出液體

添加鬼筆環(huán)肽溶液（100μL/孔）

在室溫下染色細(xì)胞20至90分鐘

清洗細(xì)胞在顯微鏡下觀察樣品

注意：將小瓶加熱至室溫并在打開前短暫離心。

 

操作步驟

1.制備1000 X鬼筆環(huán)肽DMSO儲(chǔ)備液：將30μLDMSO加入裝有粉末的小瓶中。

2.制備1X鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液：加入1μL1000X鬼筆環(huán)肽綴合物DMSO溶液至1 mL含1％BSA的PBS。

注意1：鬼筆環(huán)肽綴合物未使用的1000X DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)等分并儲(chǔ)存在-20℃，避光。

注意2：不同的細(xì)胞類型可能染色不同。 應(yīng)相應(yīng)地制備鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液。

3.染色細(xì)胞：

3.1進(jìn)行甲醛固定，在室溫下將含3.0-4.0％甲醛的細(xì)胞在PBS中孵育10-30分鐘。

注意：避免使用任何含的固定劑，因?yàn)闀?huì)在固定過程中破壞肌動(dòng)蛋白。 優(yōu)選的固定劑是不含的甲醛。

3.2用PBS沖洗固定的細(xì)胞2-3次。

3.3可選：在PBS中加入0.1％Triton X-100固定細(xì)胞3至5分鐘，以增加滲透性。 用PBS沖洗細(xì)胞2-3次。

3.4將100μL/孔（96孔板）鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液加入固定的細(xì)胞，并在室溫下染色細(xì)胞20至90分鐘。

3.5在加上蓋玻片之前，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2至3次以除去過量的鬼筆環(huán)肽綴合物，然后在顯微鏡下進(jìn)行，密封和成像。





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