如何用濾膜法測(cè)細(xì)菌總數(shù)

時(shí)間：2024-12-27作者：上海川昱實(shí)驗(yàn)儀器有限公司瀏覽：401

基于濾膜上細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)
【摘要】 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)在質(zhì)量監(jiān)測(cè)中具有重要的意義，目前除了經(jīng)典的平板培養(yǎng)法以外，還有微菌落法、阻抗法等檢測(cè)方法，這些方法或者需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，或者需要較高的檢測(cè)成本。本研究提出一種不需要培養(yǎng)而在濾膜上直接計(jì)數(shù)的細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)方法，它主要分為過(guò)濾、染色、顯微鏡計(jì)數(shù)和計(jì)算四個(gè)步驟。計(jì)算細(xì)菌總數(shù)時(shí)，根據(jù)細(xì)菌在濾膜上的分布特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)公式進(jìn)行改進(jìn)，提出按區(qū)域計(jì)算細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算方法，提高了檢測(cè)精度。研究結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無(wú)顯著性差異（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一種低成本、的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法。
1 引 言
細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)的研究已有很多，目前規(guī)定的方法為平板計(jì)數(shù)法，該方法是將樣品加入瓊脂營(yíng)養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。這種方法精度高，但耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足實(shí)際工作需要。為了簡(jiǎn)化檢測(cè)程序、縮短檢測(cè)時(shí)間，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的檢測(cè)方法的研究，提出了阻抗檢測(cè)法〔1〕、Simplate TM全平器計(jì)數(shù)法〔2〕、微菌落技術(shù)〔3-5〕、紙片法〔6-7〕等檢測(cè)方法，了的成果，但檢測(cè)時(shí)間仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基礎(chǔ)上，提出了在濾膜上染色后，直接計(jì)數(shù)的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法，具體步驟為：用集菌儀進(jìn)行細(xì)菌收集→在膜上進(jìn)行染色→在油鏡下計(jì)數(shù)→按公式計(jì)算出菌液濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無(wú)顯著性差異，檢測(cè)時(shí)間約1 h，是一種的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法。
2 材料與方法
2.1 材料
本研究中用的試驗(yàn)材料有集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），染色劑，生物顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司），聚碳酸脂膜（直徑47 mm）。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 準(zhǔn)備工作 卸下集菌儀的濾網(wǎng)（見(jiàn)圖1），統(tǒng)計(jì)濾網(wǎng)上小孔總數(shù)，為計(jì)算菌液濃度做準(zhǔn)備。另外，還需對(duì)集菌儀中的集菌器進(jìn)行高壓滅菌，以防止過(guò)濾過(guò)程中引入外源細(xì)菌。
2.2.2 細(xì)菌收集 取濃度的霉菌菌液300～500 ml，裝在集菌儀上，集菌儀采用蠕動(dòng)加壓方式對(duì)菌液施加的壓力，使菌液流過(guò)孔徑為0.45 um的聚碳酸脂膜。采用過(guò)濾方法是因?yàn)樗梢允辜?xì)菌相對(duì)均勻地分布在濾膜上，而選用聚碳酸脂膜是因?yàn)檫@種膜具有良好的透光性，便于用顯微鏡觀察。
2.2.3 染色 集菌后取下濾膜，切下一部分放在載玻片上，進(jìn)行染色、固定。染色的目的是增大細(xì)菌與背景的對(duì)比度，便于觀察。
2.2.4 顯微鏡計(jì)數(shù)與計(jì)算 菌液經(jīng)集菌儀過(guò)濾后，細(xì)菌在濾膜上的分布見(jiàn)圖2、圖3，由圖可以看出細(xì)菌分布具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：一是細(xì)菌集中在一個(gè)個(gè)的圓形區(qū)域內(nèi)，這些圓形區(qū)域和擋板的小孔相對(duì)應(yīng)；二是各個(gè)圓形區(qū)域之間細(xì)菌很少。根據(jù)膜上細(xì)菌分布的這種特點(diǎn)，提出以圓形區(qū)域?yàn)閱挝贿M(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)出圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌的平均個(gè)數(shù)，從而計(jì)算出菌液中細(xì)菌總數(shù)。具體步驟如下：隨機(jī)選擇10個(gè)圓形區(qū)域，在油鏡下，調(diào)節(jié)焦距以獲得較清晰的圖像（見(jiàn)圖4），統(tǒng)計(jì)每個(gè)圓形區(qū)域內(nèi)的細(xì)菌個(gè)數(shù)，然后按公式(1)計(jì)算出菌液的濃度。
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