【抗體類藥物質(zhì)量檢測】

時間：2021-04-08作者：廣東省華微檢測股份有限公司瀏覽：342

一、 國內(nèi)外法規(guī)技術指南介紹
近年來醫(yī)藥工業(yè)對于生物大分子藥品質(zhì)量控制實踐經(jīng)驗的不斷積累、分析手段的持續(xù)進步，以及質(zhì)量源于設計、風險評估等****藥品質(zhì)量控制理念的逐步推廣，推動了各類生物藥質(zhì)量控制**指南、法規(guī)的修訂?？贵w類藥物屬于重組技術產(chǎn)品，質(zhì)量控制方面應滿足國內(nèi)外重組技術產(chǎn)品相關要求。目前新版《WHO重組DNA產(chǎn)品質(zhì)量安全有效性評價指南》(WHO Guidelines on Quality， Safety， and Efficacy of Biological Medicinal Products Prepared by Recombinant DNA Technology)已頒布；《歐洲藥典》(Monoclonal Antibodies for Human Use)《美國藥典》(Control Strategies for RecombinantTherapeutic Monoclonal Antibodies)均設立了針對抗體類產(chǎn)品的總論，即 General Monograph或 General Chapter；ICHQ5、Q6、Q8-Q11等技術指南為抗體類產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了指導性的范本。由于眾多生物藥物面臨**保護到期，為了確保生物類似藥的質(zhì)量與安全，歐盟于2006年首先頒布實施了生物類似藥的指南，WHO和FDA也先后于200年和2012年頒布了生物類似藥指南，并影響了亞洲、南美洲、中東、非洲等醫(yī)藥工業(yè)相對欠發(fā)達的國家和地區(qū)類似法規(guī)的制定。近兩年這些國家都對已頒布的生物類似藥指南進行了修訂，WHO也新增了針對單克隆抗體生物類似藥的技術指導原則。
中國也于2015年2月發(fā)布了《生物類似藥研發(fā)與評價指導原則》。上述指南和法規(guī)中有大量是關于生物大分子量控制技術要求的論述，使包括抗體在內(nèi)的生物大分子藥物質(zhì)量有了進一步提升的空間。
《中國藥典》(四部)頒布了我國單克隆抗體類生物**藥物的總論和重組DNA技術產(chǎn)品總論，在此基礎上制定相應品種各論，對新產(chǎn)品的質(zhì)量標準化研究具有重要的指導意義。在抗體類藥物質(zhì)量控制方面，應當依據(jù)或參照以上藥典標準進行，同時也應參照《人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術指導原則》《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術指導原則》等相關國內(nèi)法規(guī)和技術指導原則的要求。
二、細胞株的質(zhì)量控制
細胞株的質(zhì)量控制在《中國藥典》(2020版)(三部)通則“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”中有非常具體的規(guī)定，用于生物制品生產(chǎn)和檢定的細胞株需通過全面的檢定，目前單抗的細胞株主要有鼠源的SP20、NS0和CHO細胞株這幾種細胞除一般的細胞株的特征外，還可能攜帶鼠源性的病毒等外源因子的污染，特別是自身攜帶的逆轉(zhuǎn)錄病毒，動物試驗顯示具有致**性，因此必須嚴格控制細胞株的質(zhì)量。申報單位不僅要提供規(guī)定十分詳實的文件資料，還要有具體的試驗結果，特別是包括病毒滅活工藝在內(nèi)的工藝驗證資料，并經(jīng)過國家有關管理部門的認可或批準。


2.1 重組工程細胞的構建

宿主細胞的選擇宿主細胞的選擇主要基于兩個方面的考慮：安全性及適用性?；诎踩目紤]，宿主細胞的來源及培養(yǎng)歷史應十分清楚，可溯源有關背景資料，例如，較初分離建立株/系的機構、是否有外源添加序列、傳代經(jīng)過及傳代過程中所用過的人源或動物源性材料、細胞可能存在的內(nèi)源病毒及致瘤性等。對于改良的傳代細胞、全新構建的轉(zhuǎn)化細胞等，由于前期研究、背景資料和致瘤性風險等積累的認識十分有限，其開發(fā)應用將引人新的安全性隱患，需要慎重權衡利弊，在開展充分研究的基礎上嚴格控制潛在的風險性。
構建過程中的質(zhì)量控制目前可采用多種表達載體、基因?qū)敕椒ê秃Y選標記等進行工程細胞的構建及篩選，構建成功的標志是工程細胞能夠穩(wěn)定、高效地表達結構正確且具有生物活性的抗體。構建過程應有詳細的克隆基因的序列，包括插入的抗體基因及表達載體兩側(cè)端制區(qū)的核苷酸序列；應詳細說明載體引入宿主細胞的方法、載體在宿主細胞內(nèi)的狀態(tài)(是否整合到染色體內(nèi))及拷貝數(shù)；應提供宿主和載體結合后的遺傳穩(wěn)定性資料；應詳細敘述在生產(chǎn)過程中，啟動和控制克隆基因在宿主細胞中的表達所采用的方法及表達水平。


2.2 細胞庫的建立細胞庫的建立是為了保證重組單抗生產(chǎn)的穩(wěn)定性及批間一致性。參照《中國藥典》(2020版)(三部)中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”的要求，細胞庫為三級管理，即原始細胞庫、主細胞庫及工作細胞庫。如為引進的細胞，可采用主細胞庫和工作細胞庫組成的二級細胞庫管理。在某些特殊情況下，也可使用主細胞庫級細胞庫，但須得到**藥品監(jiān)督管理部門的批準。

原材料的選擇及細胞操作要求用于建庫的初始工程細胞株應為經(jīng)過克隆選擇而形成的均一細胞群體，必要時須經(jīng)與實際生產(chǎn)過程采用的無血清培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件相一致的適應性培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)及擴增所用原輔料應按照國家藥品監(jiān)督管理總局有關規(guī)定執(zhí)行；動物源性原料的使用應提供來源及質(zhì)控檢測資料；細胞培養(yǎng)液不得含有人血清，不得使用青霉素或β-內(nèi)酰胺類抗生素；細胞操作過程應符合現(xiàn)行版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求。生產(chǎn)人員應定期檢查身體。為避免微生物污染和實驗室中其他類型細胞的交叉污染，在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進行微生物或非生產(chǎn)用細胞的操作；在同一工作日進行細胞操作前，不得操作或接觸有感染性的微生物或動物。
原始細胞庫（PCB）重組工程細胞經(jīng)過克隆培養(yǎng)形成的均一細胞群體，通過檢定可用于重組單抗的生產(chǎn)，在特定條件下，將一定數(shù)量、成分均一的細胞懸液，定量均勻分裝于安瓿，于液氮或-130℃以下凍存，即為原始細胞庫，供建立主細胞庫用。
主細胞庫（MCB）
取原始細胞庫細胞，經(jīng)過一定方式進行傳代、增殖后均勻混合成一批，定量分裝保存于液氮或-130℃以下，經(jīng)全面檢定合格后，即為主細胞庫，用于工作細胞的制備。
工作細胞庫（WCB）工作細胞庫的細胞由MCB細胞傳代擴增制成。由MCB的細胞經(jīng)傳代擴增，達到定代次水平的細胞，合并成一批均質(zhì)細胞懸液，定量分裝于安瓿或適宜的細胞凍存管，保存于液氮或-130以下備用，即是工作細胞庫。生產(chǎn)企業(yè)的工作細胞庫必須限定為一個細胞代次，凍存細胞的傳代水平需確保細胞復蘇后傳代增殖的細胞數(shù)量能滿足生產(chǎn)一批制品。復蘇后細胞的傳代水平不應**過批準用于生產(chǎn)的較高限定代次。


2.3 細胞庫的管理

細胞庫中每支細胞應有明確的標記，包括細胞系/株名、代次、批號、編號、凍存日期、儲存容器的編號等；凍存前的活細胞比例應不**90%，復蘇后細胞存活率應不**80%，凍存后的細胞應至少做一次復蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代至衰老期，檢查不同傳代水平的細胞生長情況；主細胞庫和工作細胞庫應分別存放，非生產(chǎn)用細胞應與生產(chǎn)用細胞嚴格分開存放。上述各級種子庫的細胞應按照特定的要求經(jīng)過全面檢定合格后方可使用。

2.4 細胞的檢定

合格的生產(chǎn)細胞是得到合格的重組抗體的前提和基礎，為保證產(chǎn)品的安全性和有效性，應對生產(chǎn)細胞進行全面的檢定?！吨袊幍洹?2015版)(三部)中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”及“重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制技術評價一般原則”對細胞的質(zhì)控內(nèi)容作了較為詳細的闡述，主要包括細胞的鑒定及微生物污染的檢定。重組單抗生產(chǎn)細胞作為經(jīng)過DNA重組技術獲得的含有特定基因序列的細胞系，在質(zhì)控內(nèi)容方面還增加了細胞穩(wěn)定性的考察、抗體基因或抗體的鑒別試驗、細胞產(chǎn)物中外源病毒因子的檢測。

由于生產(chǎn)細胞分三級細胞庫管理，對于原始庫細胞和/或主庫細胞，通常需要進行一次全面系統(tǒng)的研究檢定，包括遺傳學、生物學和微生物學檢定，以保證起始細胞的一致性并排除污染。經(jīng)過傳代穩(wěn)定性研究的主細胞到工作細胞，只經(jīng)過簡單的傳代、擴增，可適當簡化檢定項目，重點檢測外源因子污染和細胞污染。

細胞的鑒定
細胞鑒別試驗：現(xiàn)行藥典規(guī)定，新建細胞庫(MCB和wCB)及生產(chǎn)終末細胞應進行細胞鑒別試驗，以對細胞的種屬來源進行確證并排除其他細胞的交叉污染。細胞鑒別可通過生長形態(tài)、生化檢測法(如同工酶法)免疫學檢測(如組織相容性抗原、中和特異性免疫血清)遺傳學檢測(如染色體核型、標記染色體檢測)遺傳標志檢測(如DNA指紋圖譜、STR圖譜、基因組二核苷重復序列)等方法進行；
抗體基因及抗體的鑒別試驗：抗體基因的檢測是抗體生產(chǎn)細胞鑒別試驗的重要組成部分，其目的是保證生產(chǎn)細胞中抗體基因的正確與完整，以得到結構正確的抗體產(chǎn)品。常用的方法包括：通過PCR擴增樣本DNA或用從細胞基質(zhì)中分離的RNA制備的cDNA來進行DNA序列分析；通過限制酶酶譜和 Southern雜交來檢測基因的完整性確定目的基因的拷貝數(shù)，并檢測是否有任何序列插入或缺失等。目的基因的檢測應貫穿于工程細胞的構建及篩選、細胞庫的建立和檢定，以及生產(chǎn)細胞培養(yǎng)監(jiān)控的全過程?？贵w產(chǎn)物可通過免疫斑點或免疫印跡試驗等進行鑒別；
致瘤性鑒定：目前生產(chǎn)重組單抗經(jīng)常用到的細胞株CHO、NS0、C127等已證明具有致瘤性，國外指導原則通常不再要求進行致瘤性檢查，但對于該細胞來源的制品，要優(yōu)化生產(chǎn)工藝，嚴格限制致瘤性成分如宿主殘余DNA在成品中的含量；現(xiàn)行藥典也規(guī)定對于已證明具有致瘤性的傳代細胞可不必進行致，性檢查，但一般認為生產(chǎn)中應用的插入外源基因的工程細胞應當視為全新的細胞，必須進行致瘤性的檢查，并在細庫檢定中進行傳代/擴增過程中的對比試驗，觀察致瘤性特征的改變，并制定后續(xù)處理工藝條件和限制性要求，對致瘤性帶來的安全性風險進行控制；
致瘤性試驗可通過體內(nèi)試驗和體外試驗進行。體內(nèi)試驗有裸鼠法和新生小鼠法，體外法可采用軟瓊脂克隆形成試驗或器官培養(yǎng)試驗，具體實驗操作參見現(xiàn)行藥典中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)。
病原微生物檢測
細菌、真菌及支原體檢查：對細胞培養(yǎng)上清液進行無菌檢查，結果須符合規(guī)定要求。使用的培養(yǎng)基應適合需氧菌、厭氧菌和真菌的生長，并且培養(yǎng)基的靈敏度要滿足要求。無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法，如供試品允許，應**采用薄膜過濾法。對于直接接種法，若制品中含有防腐劑，應**增菌培養(yǎng)。在進行支原體檢查時，應注意同時進行培養(yǎng)法和指示細胞法兩種方法；
內(nèi)、外源病毒因子檢查：用于確定待檢細胞中是否存在潛在的可感染的病毒如鼠源性病毒)及操作帶人的外源性病毒。檢測病毒的種類及方法須根據(jù)細胞的種屬來源及細胞特性決定，對于重組工程細胞來說，還應當對細胞裂解物或收獲液進行外源因子檢測。
一般病毒因子可通過細胞形態(tài)觀察及紅細胞吸附試驗、不同細胞傳代培養(yǎng)法及接種動物和雞胚法檢測，其中《中國藥典》(2015版)(三部)中新增規(guī)定：用不同細胞傳代培養(yǎng)法檢測病毒因子時，應設立病毒陽性對照，包括可觀察細胞病變的病毒陽性對照及血吸附陽性對照。另外，新版藥典對檢定用細胞也增加了明確要求，具體參見《中國藥典》(2015版)中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”。對于逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測，現(xiàn)行藥典規(guī)定：小鼠來源和其他嚙齒類來源的細胞系或其雜交瘤細胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此，對于人-鼠雜交瘤細胞系應進行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測。如用于單克隆抗體生產(chǎn)的小鼠細胞系，則可不檢測特異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，但在生產(chǎn)工藝中應增加病毒滅活程序。根據(jù)待檢細胞系/株的種屬及組織來源，還應進行特殊外源病毒因子的檢測。如為鼠源細胞系，一般檢測出血熱病毒、淋巴細胞脈絡從腦膜炎病毒、Ⅲ型呼腸孤病毒、仙臺病毒、脫腳病病毒、小鼠腺病毒、小鼠肺炎病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等；如為人源細胞系，應檢測人鼻咽癌病毒、人巨細胞病毒、人逆轉(zhuǎn)錄病型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒等。
細胞株的穩(wěn)定性研究抗體生產(chǎn)細胞一般為通過基因工程獲得的重組工程細胞，生產(chǎn)者須具有相關的穩(wěn)定性研究資料，包括重組細胞的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達穩(wěn)定性、目的產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性，以及一定條件下保存時細胞生產(chǎn)抗體產(chǎn)品能力的穩(wěn)定性等資料。





三、抗體藥物的表征分析




單克隆抗體是迄今為止分子量僅次于重組人凝血因子Ⅷ的藥用蛋白，其分子結構具備高度的復雜性。IgG型抗體是由兩條重鏈(≈50kDa)和兩條輕鏈(≈25kDa)經(jīng)鏈間二硫鍵相連，所構成的“Y”形四聚體糖蛋白。一般在抗體的恒定區(qū)或可變區(qū)還存在MO糖基化修飾?？贵w藥物與藥物靶標特異性結合后，通過阻斷細胞信號轉(zhuǎn)導通路，或誘導效應功能，如抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)補體依賴的細胞毒作用(CDC)、抗體依賴的細胞介導的細胞吞噬作用(ADCP)或運載偶聯(lián)小分子化藥等多種方式發(fā)揮作用。由于重組抗體的制備工藝采用動物細胞異源表達，其分子結構上存在多種翻譯后修飾。因此，抗體藥物的結構還具有顯著的“異質(zhì)性”或“非均一性”的特點。根據(jù)IgG型抗體潛在的修飾位點(NO糖基化、焦谷氨酸環(huán)化、賴氨酸剪切、天冬氨酸異構及甲硫氨酸氧化等)，推測出的理論變異體至少有108種，這些修飾變異又表現(xiàn)為分子大小、電荷、糖譜等多種形式的差異。臨床研究已經(jīng)證實，某些抗體藥物的變異體具有不同的藥代、藥效和免疫原性屬性?？梢哉f，抗體分子結構上存在的“復雜性”和“異質(zhì)性”，決定了抗體藥物表征研究的難度與挑戰(zhàn)。正確的分子結構是保證抗體藥物安全、有效的物質(zhì)基礎。質(zhì)量研究中對抗體藥物進行全面的表征研究是進行質(zhì)量控制的重要手段。因此，國內(nèi)外關于抗體藥物研發(fā)的指導原則均強調(diào)，抗體藥物的表征研究應采用現(xiàn)有**的分析手段( state-of-the-art)，從物理化學、免疫學、生物學等角度對產(chǎn)品進行全面的分析，并提供盡可能詳盡的信息以反映目標產(chǎn)品內(nèi)在的質(zhì)量屬性。下文將結合抗體藥物具體案例，介紹抗體藥物表征研究的主要內(nèi)容與一般方法。

一級結構
分子量
由于抗體的恒定區(qū)具有糖基化修飾，一般經(jīng)過脫糖處理后測定分子量。通過實測值和理論值的比較，可以初步判定抗體藥物序列是否正確。例如，某曲妥珠生物類似藥完整蛋白分子量與原研參比存在64Da差異，重鏈分子量與原研參比存在32Da差異，因此，可初步判定該生物類似藥重鏈氨基酸序列存在錯誤或翻譯后修飾。
氨基酸序列
抗體藥物的一級結構(氨基酸序列)是其生物活性、臨床療效的物質(zhì)基礎，尤其是對于生物類似藥而言，確保氨基酸序列與原研參比一致是首要條件。一般重組抗體經(jīng)蛋白酶切(LsC、AspN或GuC)后，利用串聯(lián)液相質(zhì)譜技術進行肽質(zhì)量圖譜分析來確證氨基酸序列。例如，上文提及的曲妥珠生物類似藥經(jīng)肽質(zhì)量圖譜分析確定，其分子量差異位于胰蛋白酶酶切肽段T35上。在生物類似藥開發(fā)的早期篩選階段也會出現(xiàn)一級結構的改變，均可以利用質(zhì)譜技術予以鑒定。
氨基酸含量分析
重組抗體酸水解后，經(jīng)衍生化試劑處理后可使用液相定量分析其氨基酸含量。但是由于水解過程中對于穩(wěn)定性差的氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸等)破壞較大，或某些氨基酸因空間位阻原因難于水解(異亮氨酸)，某些氨基酸的實際測定值偏低。此外，對于生物大分子而言，氨基酸含量僅是其一級序列確證的佐證，并不能表明其氨基酸序列的正確性。因此，氨基酸含量分析在抗體藥物的結構確證研究中意義有限。
N/C端異質(zhì)性
N端測序是抗體藥物一級結構鑒定的重要方法，通常將還原后的抗體輕、重鏈經(jīng)Edman降解依次測定N端氨基酸序列。若抗體的N端存在焦谷氨酰封閉，需采用焦谷氨肽酶去封閉后再進行 Edman降解測定。重組表達的抗體藥物由于工程細胞內(nèi)羧肽酶D的降解，還會導致重鏈C端賴氨酸不完全剪切。目前，已經(jīng)證實重組抗體普遍存在著NC端異質(zhì)性的現(xiàn)象，并且沒有證據(jù)表明NC端異質(zhì)性對抗體的安全性、有效性產(chǎn)生影響。但是，通過NC異質(zhì)性的分析有助于加強重組抗體藥物的質(zhì)量控制。為了減少C端的異質(zhì)性，亦有通過基因水平去除末端賴氨酸的設計。
氨基酸修飾分析
抗體藥物的質(zhì)量肽圖通過測定肽段分子量及二級碎片分子量，可以進一步分析氨基酸的修飾類型及其比例，如脫酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修飾、N端焦谷氨酸環(huán)化、C端賴氨酸切除等。目前已經(jīng)證實在加速降解條件下，抗體CDR區(qū)氨基酸的化學修飾可能會影響其親和力和生物學活性。鑒定修飾的類型及位置可作為抗體藥物CQA評定的重要指標。
糖基化修飾
除了個別改構的IgG1(N297A)型抗體不具有糖基化修飾外，絕大多數(shù)抗體和抗本融合蛋白均存在M糖或O-糖修飾?？贵w的M糖修飾發(fā)生在“Asn- X-Ser/Thr”(X為除Pro外的任意氨基酸)序列中的Asn位點。O糖修飾沒有特殊基序結構，多發(fā)生在抗體融合蛋白序列的Ser和Thr的羥基上。糖基化修飾在維持抗體正常結構和生物活性上發(fā)揮著重要作用。例如，高半乳糖修飾可提高抗體的CDC效應；低巖藻糖修飾可提高抗體的ADCC、ADCP效應；而a1,3半乳糖或NGNA等非人糖基化修飾則可在臨床上引起免疫原性等，
因此，需要對糖基化位點、寡糖分布及糖鏈結構等進行充分研究。例如，阿巴西普存在3個M糖基化修飾位點和4個O糖基化修飾位點；依那西普含有3個N糖修飾位點和13個0糖修飾位點；西妥昔單抗在Fab和Fe區(qū)域均具有M糖修飾。寡糖分布是對抗體藥物中不同修飾形式的寡糖鏈所占比例進行分析。一般使用糖苷酶酶切糖鏈后，經(jīng)衍生化處理，使用液相色譜分析確定各寡糖鏈所占的比例。在抗體藥物的質(zhì)量控制中，對于影響抗體效應功能的寡糖分布，應重點關注并進行控制。例如，以ADCC效應為主要作用機制的曲妥珠單抗，應重點關注影響恒定區(qū)效應功能的寡糖分布，但是曲妥珠單抗原研產(chǎn)品不同批次的糖基化修飾亦有較大的變異。糖鏈的結構分析一般釆用多種糖苷酶分步酶切確定單糖連接方式，通過測定糖鏈分子量預測糖鏈結構。
二級結構
二硫鍵
IgG型抗體由兩條輕鏈和重鏈，通過鏈間二硫鍵組裝而成。二硫鍵的構型有時可以顯著影響抗體的功能。二硫鍵的測定通常采用酶切后質(zhì)量肽圖譜的方法，通過測定還原與非還原狀態(tài)的酶切分子量或通過二硫鍵肽段的二級質(zhì)譜碎片來確證抗體二硫鍵配對情況?？贵w藥物的表征研究既要驗證正確的二硫鍵配對，也要關注二硫鍵錯配形式。對于**性抗體應用較多的IgG亞型：IgG1和IgG4抗體分子內(nèi)含有16個二硫鍵，其中鏈內(nèi)二硫鍵12個，鏈間二硫鍵4個；1gG2抗體分子內(nèi)含有18個二硫鍵，其中鏈內(nèi)二硫鍵12個，鏈間二硫鍵6個；而對于復雜的抗體融合蛋白依那西普，則含有29個二硫鍵和多種錯配形式二硫鍵。
自由巰基
理論上含完整二硫鍵的IgG抗體分子內(nèi)應不存在自由巰基，但是由于有些抗體存在額外的半胱氨酸或者存在未形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，抗體分子中一般含有少量的自由巰基(0.02 mol/mol蛋白左右〉通常采用 ELLMAN試劑法測定自由巰基，其原理為DTNB與抗體的自由巰基反應后生成TNB，根據(jù)TNB吸光度確定抗體的自由巰基含量。
**結構測定抗體分子**結構的常用方法是圓二色譜法，該方法利用蛋白質(zhì)的圓二色性及不對稱分子對左右圓偏振光吸收的不同來進行結構分析。遠紫外區(qū)(190-230mm)光譜可反映蛋白質(zhì)二級結構，即α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲的比例。近紫外區(qū)(250-350mm)光譜反映蛋白三級結構變化，即側(cè)鏈生色基團色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環(huán)境的變化；此外，差示掃描量熱法、氫氘交換質(zhì)譜傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜X光晶體學核磁共振技術等也常用于分析抗體藥物的**結構。
免疫學活性可變區(qū)抗原親和力
抗體藥物的靶向特異性體現(xiàn)在其可變區(qū)與靶抗原特異性結合，可變區(qū)的抗原親和力一般采用酶聯(lián)免疫吸附法、流式細胞術和BA法等方法進行測定。采用競爭ELSA法測定抗體結合活性時，將供試品與標準品與酶標抗體竟爭結合包被抗原，對抗體濃度與吸光值的量效關系進行四參數(shù)擬合后，計算供試品與標準品的ECs值來評價抗體藥物的結合活性；流式細胞術通過測定抗體與表達抗原的靶細胞之間的結合陽性率，評價抗體與細胞表面抗原的結合活性；BIA法是通過實時、動態(tài)監(jiān)測抗體與芯片表面固化的抗原之間的結合解離反應，計算出抗體的親和常數(shù)等動力學參數(shù)。
恒定區(qū)效應功能
抗體的恒定區(qū)通過與FcR結合介導ADCC、ADCP等功能，通過與C1q結合介導CDC功能，通過與新生兒受體FRn結合延長抗體在體內(nèi)的半衰期。因此，可以通過測定抗體與相應受體結合力(CD16，C1q)來間接反映其潛在體內(nèi)效應功能，也可以采用基于細胞的生物測活方法直接測定恒定區(qū)介導的效應功能。例如，采用新鮮分離的人外周血單個核細胞或NK細胞作為效應細胞，或者采用報告基因法測定抗體介導的ADCC效應；采用補體與靶細胞共孵育的方法，測定抗體介導的CDC效應。
生物學活性抗體藥物的生物活性直接反映了其臨床應用的體內(nèi)效力，是抗體藥物質(zhì)量控制的重要指標。抗體藥物的生物學活性測定，一般采用體外細胞法或動物模型法模擬藥物的體內(nèi)作用機制，并通過與活性標準品的比較對其量效關系進行賦值評價。
常用生物活性測定方法主要有細胞增殖抑制法、細胞毒性法、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性法和補體依賴的細胞毒性法等。例如，靶向細胞生長因子(VEGF、Her2、BGFR等)抗**單抗均采用表達靶抗原的細胞( HUVEC、BT474、DiFi等)進行細胞增殖抑制實驗進行生物測活；靶向TNF-α的抗體或融合蛋白，根據(jù)拮抗TNF-α對敏感細胞系(L929細胞)的殺傷活性測定生物活性；利妥昔單抗通過測定介導補體對靶細胞的殺傷測定生物活性等。近年來，除了上述采用原代細胞生物測活外，通過導入抗體靶標和報告基因構建的轉(zhuǎn)基因指示細胞株開始應用于抗體藥物的生物測活。例如，靶向PD-1或PDL1單抗采用穩(wěn)轉(zhuǎn)NFAT報告基因和人PD1的 Jurkat細胞作為效應細胞，采用高表達人PDL1的CHO細胞作為靶細胞。在效應細胞與靶細胞共孵育條件下加入抗體，根據(jù)熒光素酶檢測系統(tǒng)評價抗PDL1抗體生物活性。
對于抗體藥物而言，表征研究始終貫穿著藥物研發(fā)的生命周期。申請臨床前，在工藝開發(fā)、CQA、CPP評估、質(zhì)量研究和穩(wěn)定性研究中對候選藥物進行充分的表征研究有助于盡早鎖定生產(chǎn)工藝，確定批次放行質(zhì)量標準和產(chǎn)品的儲存條件及有效期；產(chǎn)品申請上市前，對工藝驗證批次產(chǎn)品的質(zhì)量進行表征研究，可以證明擬上市規(guī)模下生產(chǎn)工藝的穩(wěn)健性和產(chǎn)品質(zhì)量的一致性；在產(chǎn)品上市后，如果發(fā)生生產(chǎn)工藝的變更，要提供變更前后多批次產(chǎn)品的表征研究數(shù)據(jù)，以支持工藝變更前后產(chǎn)品質(zhì)量具有“可比性”。此外，近年來國內(nèi)外正在興起抗體生物類似藥研發(fā)的熱潮。其中，對多批次原研參比和生物類似藥進行全面表征比對研究，也是證實生物類藥具備“質(zhì)量相似性”，進而減免非臨床、臨床研究的關鍵所在。


四、抗體藥物的純度和雜質(zhì)分析

4.1 大小異質(zhì)性分析

純度測定是重組蛋白藥物的一項重要檢測指標，該指標直接反映了抗體純化工藝水平及產(chǎn)品質(zhì)量的高低?？贵w純度測定主要涉及兩個方面的問題。一是抗體分子與雜質(zhì)的有效分離。在實際測定中，某些產(chǎn)品相關雜質(zhì)，如肽鏈截短或延長形式、修飾形式、聚合體、多聚體等，由于性質(zhì)與主蛋白比較接近，分離起來可能有些困難，須選用合適的分離方法。二是對主蛋白及雜質(zhì)的檢測與定量。常用的檢測器有紫外檢測器、凝膠成像掃描儀、熒光檢測器、電化學檢測器、示差檢測器、蒸發(fā)光檢測器、質(zhì)譜檢測器等。由于各種檢測器靈敏度的限制，有些生產(chǎn)純化過程及操作環(huán)境中引人的微量雜質(zhì)不易檢測到。為避免一種檢測方法在蛋白純度檢測中的偏差，一般選用至少兩種分離方法進行檢測，以得到相對準確的純度信息。測定抗體純度的常用方法是非還原型或還原型SDSPAGE或 CE-SDS法、分子排阻色譜法( SEC-HPLC)等方法，對單體、聚合體或片段進行定量分析，如供試品具有Fc效應子功能，則還需關注非糖基化重鏈的情況。供試品測定結果應在規(guī)定的范圍內(nèi)。

單克隆抗體(單抗)由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，相對分子量高達15萬Da左右，結構復雜，其*小異質(zhì)性是單抗的重要質(zhì)控指標之一。大小異質(zhì)性一般可分為三類，即單體、片段和多聚體。片段包括降解的單抗和組裝不完全的重輕鏈等；而多聚體則包括二聚體、寡聚體或較復雜的聚體等，多聚體不僅可能是單抗中的無效成分，還是導致單抗免疫原性的重要原因之一，所以大小異質(zhì)性是單抗生產(chǎn)工藝優(yōu)化、生產(chǎn)過程控制及放行分析中不可或缺的檢測項目，也是單抗穩(wěn)定性評價的重要指標之一。隨著技術的進步，單抗大小異質(zhì)性的分析手段不斷涌現(xiàn)，不同的分析技術其分析原理不同，所獲得的結果反映單抗在大小異質(zhì)性方面不同的特性。由于 SEC-HPLC及 CE-SDS相對簡單易行，成為分析單抗類制品大小異質(zhì)性的兩種常規(guī)方法。有研究利用非還原(SDS和碘乙酰胺處理)及常規(guī)(無處理)和變性(SDS和碘乙酰胺處理) SEC-HPLC評價了一種抗ⅤEGF單抗的大小異質(zhì)性，初步闡明了二者結果差異的原因，為單抗制品的質(zhì)量控制研究提供了理論基礎。

三種分析的結果比較如圖16-1所示，可以看出非還原 CE-SDS的多聚體含量分析結果顯著**常規(guī) SEC-HPLO，但與變性 SEC-HPLC的分析結果基本一致。多聚體為共價和非共價結合兩種形式總和，而在 CE-SDS分析的情況下，由于去垢劑SDs的存在，非共價形式的多聚體被解離成為單體，所以多聚體的含量相比常規(guī) SEC-HPLC明顯降低。在變性 SEC-HPLC分析的情況下，由于SDS的存在，多聚體含量則與非還原CE-SDS的分析結果基本一致。所以與非還原 CE-SDS相比， SEC-HPLC可較加客觀地評價樣品中總多聚體的百分比含量。該研究分析的單抗樣品多聚體主要是以非共價鍵的形式連接，所以應注意兩種方法所得到的多聚體含量結果具有不同的含義，在分析多聚體含量時，常規(guī) SEC-HPLC分析比 CE-SDS分析較加客觀。

對于片段分析，由圖16-2可以看出，非還原 CE-SDS所分析的片段比例顯著大于常規(guī)和變性 SEC-HPLC，其主要原因是 SEC-HPLO的分辨率較低，無法對單體及大部分片段進行有效分離。單抗分子中往往有少部分重鏈和/或輕鏈的鏈間二硫鍵連接不完全，以非共價鍵與單抗其他部分相連接。而SDS可打開非共價鍵，所以在非還原CESDS分析結果中，除HHLL(全抗分子)外，還可形成HHL、H、H、H、L，以及其他與單抗非共價結合的降解片段；常規(guī) SEC-HPLO由于不能有效解離非共價結合的片段，加之其低分辨率，對片段含量的檢測有一定的局限性，所以非還原 CE-SDS和SEC-HPLC二者片段峰所代表的形式并不相同。

上述研究初步闡明了單抗類制品大小異質(zhì)性的兩種常規(guī)放行分析方法即 SEC-HPLO和非還原 CE-SDS二者結果差異的原因，為單抗制品的質(zhì)量控制研究提供了理論基礎，為單抗分子大小變異體質(zhì)檢策略提供了技術支撐。

4.2 電話異質(zhì)性分析

單抗類制品的多種翻譯后修飾可導致其電荷異質(zhì)性，而某些電荷異質(zhì)性由于對單抗穩(wěn)定性及其生物學功能發(fā)揮具有重要的影響而成為關鍵質(zhì)量屬性(CQA)，并且電荷異質(zhì)性可反映其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，所以受到生物技術產(chǎn)業(yè)界及監(jiān)管機構密切關注。成像毛細管等電聚焦電泳是單抗電荷異質(zhì)性分析的常用分析技術，可利用此方法對單抗電荷異質(zhì)性峰的組成進行初步研究。

將單抗 Ustekinumab(由SP2/0細胞表達)用羧肽酶B去除C性峰為C端賴氨酸不均一性所引起，如圖16-3所示。但是經(jīng)羧肽酶B酶切后，其主峰前仍有2個比例較高的酸性峰。為判斷唾液酸修飾對其電荷異質(zhì)性的貢獻，將羧肽酶B酶切后的抗體繼續(xù)用M糖苷酶酶切，分析其電荷異質(zhì)性，結果顯示經(jīng)過2個酶切處理后抗體2的圖譜基本上只剩1個主峰，證明抗體2的電荷異質(zhì)性主要是由C端賴氨酸的不均一性和唾液酸修飾所引起

由于單抗制品高度復雜的異質(zhì)性其質(zhì)控需要組合多種理化分析技術對其進行檢測如cIEF、 IEX-HPLC、 ICIEF、疏水高效液相色譜( HIC-HPLO)反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法，盡可能對不同電荷變異體組分進行鑒別，并規(guī)定相應的可接受標準。成像毛細管等電聚焦電泳為對其進行分析提供了一個快速、靈敏、高分離度的選擇，對保證單抗類生物技術藥物生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性及控制其質(zhì)量和提高質(zhì)量標準均具有重要意義。

4.2 雜質(zhì)分析

采用適宜的方法對供試品氧化產(chǎn)物、脫酰胺產(chǎn)物或其他結構不完整分子進行定量分析。采用適宜的方法對供試品宿主蛋白質(zhì)、宿主細胞和載體DNA、蛋白A及其他工藝相關雜質(zhì)進行檢測。由于單克隆抗體人用劑量較大，基于方法學靈敏度考慮，目前殘余DNA檢測常用方法是定量PCR法，樣品需要經(jīng)過前期抽提處理，因此應對抽提及定量PCR整個過程進行方法學驗證。重組抗體多由哺乳動物細胞表達產(chǎn)生，在抗體的純化過程中不可能將宿主細胞蛋白完全去除，殘留的異體蛋白進入人體有可能引發(fā)免疫反應，故需對殘留蛋白量進行限制。宿主細胞蛋白殘留量檢測中，除雜交法(WB、2DWB、2 D-DIGE)和傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜法外，ELSA方法是目前較常用的方法，其靈敏度**上述兩種方法。

ELISA方法檢測HCP效率受所使用抗體對殘留HCP的覆蓋率的影響，而殘留FCP種類受生產(chǎn)細胞株、細胞培養(yǎng)工藝和下游純化工藝等多種因素的影響。因此需要對商用試劑盒的適用性進行方法學驗證，并建議開發(fā)工藝相關的HCP檢測方法。在蛋白A殘留量檢測中，對抗體進行純化時會應用蛋白A親和柱，柱子型號不同，所用蛋白A也有差異，USP制備了包括原料在內(nèi)的4種不同類型的蛋白A標準物質(zhì)：Natural Protein A46800， Recombinant Protein A44600Cys-rpA3430， Mahselec SuRe26700。標準物質(zhì)的建立對蛋白A含量測定方法的標準化很有意義。蛋白A測定方法多采用ELSA法：將蛋白A的特異性抗體包被96孔板，加入待測樣品及蛋白A標準溶液，溶液中的蛋白A與包被抗體結合，洗滌后加入酶標抗體，加底物顯色并測定吸光值，通過標準曲線法測定待測抗體溶液中的蛋白A含量。

五、生物學活性

活性測定是對抗體類藥物的有效成分和含量及藥物效價的測定，是確保藥物有效性的重要質(zhì)控指標?？贵w類藥物可通過其Fab段結合抗原發(fā)揮生物學效應，如大多數(shù)抗細胞因子類抗體藥物即是通過和細胞因子或其受體結合阻斷從而阻斷信號通路傳導；也可通過Fc段發(fā)揮作用，單抗藥物與靶細胞表面分子結合后，可介導補體clq結合到抗體的Fe段發(fā)揮補體依賴的細胞毒效應( complement dependent cytotoxicity，cDC)，重組抗CD20、CD52單抗即是通過測定免疫復合物活化補體產(chǎn)生細胞毒作用后B淋巴蜜細胞的死亡評價其生物學活性；Fc段也可以通過和不同的FeR結合介導免疫效應抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用( antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和抗體依賴性細胞介導的吞噬作用( antibody-dependent cell-mediated phagocytosisADCP)，如圖164所示。ADCC和ADCP是許多針對腫蜜及自身免疫病的抗體類藥物重要作用機制之一。

藥物的生物學活性測定主要是在體外建立相應的細胞評價模型，模擬其作客觀的全程量效反應，并通過與活性標準品的比較對其生物學活性進行評價。近年來，轉(zhuǎn)基因細胞技術和一些新技術也被應用于抗體類藥物的生物學活性測定下文將對應用于抗體藥物活性評價的傳統(tǒng)方法和*技術進行簡要介紹，為新型抗體藥物活性方法的建立提供新的思路。

5.1 基于細胞的生物學活性測定方法

隨著藥物高通量篩選平臺的建立和生產(chǎn)規(guī)模的擴大，以及對“3R”( reduction，refinement， replacement)原則理解的不斷深化，人們越來越多地尋求動物試驗替代方法。而基于細胞系的體外生物活性分析方法，由于其高通量、高效率、高精確度等優(yōu)勢，越來越受到研究者和生產(chǎn)企業(yè)的青睞。單克隆抗體藥物的作用靶點分為細胞因子及其受體、**細胞表面抗原、CD分子、病原微生物及其產(chǎn)物、其他靶點。根據(jù)抗體藥物作用的特點，目前主要有以下幾類基于細胞的測活方法。

細胞增殖抑制法針對生長因子靶點的抗體藥物多是釆用細胞增殖抑制的方法來反映抗體的生物學活性，包括抗血管內(nèi)皮生長因子單抗、抗人表皮生長因子受體2單抗及抗人表皮生長因子受體單抗等。其中，抗VEGF單抗的經(jīng)典測活方法是人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖抑制法，即在刺激因子EGF存在的情況下，抗ⅤEGF單抗能夠以劑量依賴性的方式抑制HVEC細胞的增殖?？笻ER2單抗的活性測定通常選取HER2陽性的乳腺癌細胞，如BT474、SK-BR-3、SKOV3、MCF-7等作為靶細胞，抗體與靶細胞表面HER2抗原結合后，能夠有效抑制細胞生長信號傳遞，從而抑制細胞增殖?？笶GFR靶點單抗也是通過特異結合并封閉表皮生長因子受體，有效抑制**細胞生長，如DFi細胞、A431細胞增殖抑制法等。
細胞毒性法
細胞凋亡有兩條途徑，一是線粒體依賴途徑，另一個為死亡受體介導途徑。**壞死因子a( tumor necrosis factor-alpha，TNF-a)和受體結合后，可啟動死亡受體介導途徑，使 procaspe8自我水解、活化，形成活性 caspase-8，后者再激活 caspase3、6、7等引起下面的級聯(lián)反應，導致細胞發(fā)生凋亡。重組人Ⅱ型**壞死因子受體·抗體融合蛋白的活性測定可以利用其能夠抑制TNF-a所引起的敏感細胞系U937中 caspase3/活化，通過 Caspase-Glo3/7檢測試劑盒中熒光素酶發(fā)光信號的改變來反映該制品的活性此外，針對TNF-a的單抗還可以采用對TNF殺傷敏感的細胞系，如小鼠成纖維細胞L929、小鼠纖維肉瘤細胞WEH64等，抗體能夠抑制TNF-a所誘導的細胞凋亡作用通過檢測細胞存活的染色來評價抗體的生物學活性。
補體依賴的細胞毒法
單抗藥物與靶細胞表面分子結合后，可介導補體C1q結合到抗體的Fc段，并于**細胞膜上形成類似于穿孔素效應的攻膜復合體( membrane attack complex，MAC)造成細胞外離子大量內(nèi)流，較終導致腫蜜細胞的溶解。CDC生物學活性測定中一個關鍵環(huán)節(jié)是補體的選擇及對其質(zhì)量的控制，補體組分多，且熱不穩(wěn)定，*失活，目前所用的補體來源包括正常人血清、豚鼠、家兔等，來源復雜、劑型不同，因此在CDC實驗中需要考慮補體效力、穩(wěn)定性，盡量減少活性測定反應終點和測定結果的變異。以CD( cluster of differentiation)分子為靶點的單抗藥物，如抗CD20單抗、抗CD52單抗等，其生物學活性評價方法主要為CDC活性測定，即將重組抗體進行系列稀釋后與高表達相應CD抗原的靶細胞結合，在補體存在的情況下，抗體與細胞表面抗原形成抗原-抗體復合物，激活補體經(jīng)典活化途徑，完成攻膜復合物的裝配并在細胞表面打孔較終導致細胞溶解。
ADCC和ADCP
單抗藥物通過Fc段介導的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)的傳統(tǒng)檢測方法多為基于新鮮制備的外周血單個核細胞或者自然殺傷細胞作為效應細胞的殺傷試驗，但以上方法存在細胞分離和培養(yǎng)困難、變異大、操作繁瑣、高背景值等缺陷。近年來基于轉(zhuǎn)基因細胞法已建立了穩(wěn)定而可靠的ADCC和ADCP評價方法。ADCC和ADCP報告基因法均使用工程改造的 Jurkat細胞作為效應細胞，分別穩(wěn)定表達了其效應介導的主要受體FcRl和 CyrIlla，以及由NFAT應答元件驅(qū)動表達的熒光素酶報告基因。當高表達抗原的靶細胞與表達FRa或FcRa的 Jurkat細胞通過單抗橋聯(lián)時，可引起NFAT熒光素酶報告基因的活化，通過檢測熒光素酶化學發(fā)光信號來反映抗體的ADCC或ADCP效應(圖16-5)。該方法操作簡便易行，專屬性強、重復性好、準確性髙，通過選擇不同的靶細胞可作為抗CD20單抗、抗HER2單抗、抗EGFR單抗ADCC生物學活性的常規(guī)檢查方法，用于評價包括人鼠嵌合單抗、人源化單抗、全人源單抗和糖基化改造單抗在內(nèi)的各類抗CD20單抗、抗HER2單抗、抗EGFR單抗的ADCC活性；較重要的是，該方法可用于評價糖基化修飾與單抗Fc效應功能的關系，這也為該類制品工藝穩(wěn)定性評價及結構與功能關系評價奠定基礎。


5.2 轉(zhuǎn)基因細胞生物學活性測定方法轉(zhuǎn)基因細胞法為很多沒有強反應性細胞系，或者沒有易檢測的細胞學效應的生物技術藥物活性測定提供了選擇。轉(zhuǎn)基因細胞法具有的實驗*、批間差異小等優(yōu)勢使其較能滿足藥物批間一致性和穩(wěn)定性的測定以及監(jiān)管的需要，因此，轉(zhuǎn)基因細胞法逐漸成為生物技術藥物活性測定的趨勢，一些傳統(tǒng)的生物學活性方法逐漸被轉(zhuǎn)基因細胞法所替代。構建轉(zhuǎn)基因細胞生物學活性測定法首先應該全面深入地研究藥物的作用機制，包括受體激活、信號轉(zhuǎn)導、信號傳遞及終效應，然后，選擇合適的靶標作為藥物活性測定的指標。目前國內(nèi)在建立轉(zhuǎn)基因細胞法測定生物**藥物生物學活性領域已走在世界的**。中國食品藥品檢定研究院率先建立了干擾素測活的熒光素酶報告基因法，克服了**通用的病毒抑制法中由操作活病毒導致的缺點，使檢測周期縮短至原來的1/3，并較終納入《中國藥典》(2015版)三部。將這一理念應用于抗體藥物生物學活性的測定同樣**了較好的成果，不僅實現(xiàn)了傳統(tǒng)測活方法改進的突破，還解決了免疫檢查點等一類新藥生物活性測定的難題。


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