微生物檢測操作步驟

時間：2021-03-25

作者：廣州市微生物研究所集團股份有限公司

一、微生物取樣及樣液制備

1 樣品標識

取樣時，將樣品按不同的污染程度從低污染程度到高污染程度順序排列，

并對出對應的標識，其中按細菌數(shù)平皿、大腸菌群平皿、金黃色葡萄球菌平皿的順序，2-3個樣品一摞。

2 樣品采取

（1）固體樣品

① 開啟部位及其周圍用酒精棉進行消毒，再用火焰滅菌的剪刀剪開，

② 在電子稱上放入無菌均質(zhì)袋（手不要碰及袋口）去皮調(diào)整至零，

③ 用火焰滅菌后的剪刀和鑷子取樣，稱取25g樣品，

④ 加入225ml滅菌磷酸鹽緩沖液（開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌）后，均質(zhì)或待均質(zhì)

⑤ 擦拭干凈剪刀鑷子后浸泡于75%酒精容器中并將樣品封口；將袋子折疊后用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)約30秒作為樣液，此時均質(zhì)袋內(nèi)要設定為不含空氣（可根據(jù)樣品不同情況相應調(diào)整均質(zhì)時間）

（2）液體樣品

①冷凍樣品完全解凍后使用。

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，用滅菌吸管取充分混合后樣25ml。

③ 同上 ④ ⑤。

(3) 粉末狀樣品以及半固體樣品

①將樣品混合均一化。

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，以無菌匙采取混合后樣10g。

③加入90ml滅菌磷酸鹽緩沖液，開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌。

④ 同上⑤。

注意

1從罐頭取樣時，在表面放上小塊酒精棉（倒上少量酒精）點火燃燒后開罐。罐頭起子用酒精棉擦拭火焰滅菌后使用。

75%酒精必須保證一周換3次，如果容器內(nèi)有明顯的污物應立即更換；火焰滅菌的剪刀、鑷子通過火焰4-5s即可

二、樣液稀釋方法

①從均質(zhì)袋準確吸取樣液1ml，

②沿管壁徐徐接種到含9ml磷酸鹽緩沖液里，蓋上試管塞后充分震蕩混勻為1：100稀釋液。（勿使吸管**伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。）

③重復該操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀釋液。

④為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞增稀釋時（原液在前稀釋液在后），每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應更換一支吸管。

⑤不要在稀釋劑中吹洗吸管。

注意

1樣液稀釋必須加以足夠震搖，確保液體混勻，形成的菌落能以10倍遞增或遞減，符合邏輯性

2車間產(chǎn)品根據(jù)加工工藝或?qū)ξ廴厩闆r的估計選擇合適的稀釋倍。（尤其注意蔥、姜、蒜等無加熱類產(chǎn)品、保存實驗、外調(diào)新廠家、樣品開發(fā)、原料等樣品）。

三、樣液接種方法：

① 從吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同時在吸管尾端插上吸耳球后，從吸管尾端至**快速通過火焰，并且排空吸管里殘留的水，

② 吸管插入均質(zhì)袋樣液內(nèi)的深度不**過2.5cm處，準確吸取樣品勻液，吸管尖不要碰著袋口。吸入的液體應先**所要求的刻度, 然后提起吸管使其**離開液面并貼在袋內(nèi)將液體調(diào)至所要求的刻度。

1ml、1ml、1m、0.2ml無菌操作分別以2～4s內(nèi)完全注入已標識清楚的細菌數(shù)、大腸菌群、EC以及金黃色葡萄球菌平皿中，接種后迅速震蕩均勻，

③ 如果在接種前，某一樣品液體放置**過3 min，應重新均質(zhì)；為了驗證稀釋液、培養(yǎng)基、平皿、吸管等器具無菌需做空白對照。

四、傾注倒藥方法

右手持培養(yǎng)基三角瓶（已放50-60℃的水浴中恒溫）置火焰旁邊，用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上；也可將平皿放在火焰附近的桌面上用左手的拇指和食指打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻，如圖

注意

1培養(yǎng)基在50-60℃水浴中的保溫時間不要**過4h；從采樣開始到分注培養(yǎng)基操作限于20min以內(nèi)。

2涂布的平皿表面需干燥（干燥不充分易發(fā)生菌落擴散，有冷凝水不利于細菌分離并且會導致細菌繁殖使結果失真；干燥過分，會導致培養(yǎng)基裂開，不能用；干燥合適，則樣液吸收完全、快）。

3玻璃器皿的表面容易被細菌吸附，所以菌液注入平皿后應盡快將平皿內(nèi)的樣液和瓊脂培養(yǎng)基充分混合，否則細菌不容易分散。混合方法是將平皿傾斜和旋轉使之充分混合，但要注意不要讓培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿內(nèi)溢出，且不要粘附在平皿壁和蓋上。

五、平皿培養(yǎng)

（1）將平皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，平皿間要留有空隙進行空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達到一致，按照規(guī)定的溫度和時間進行培養(yǎng)并保持一定的濕度，經(jīng)48h培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基的失重不得**過15％，

（2）斜面、高層斜面、液體培養(yǎng)基立在試管架上放入恒溫培養(yǎng)箱中，按所規(guī)定的時間溫度進行培養(yǎng)

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詞條
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